Braz J med Biol Res, maj 2004, volym 37(5) 625-634
användningen av omvänd transkription-PCR för diagnos av X-länkad kronisk granulomatös sjukdom
P. Agudelo-fl Askorrez1, J. A. L Jacobpez1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 och A. Condino-Neto1
1Centro de Investigaubbico em pediatria, och avdelningarna för pediatrik och farmakologi, fakulteten för medicinska vetenskaper, State University of Campinas, Campinas, SP, Brasilien
2departamento of Immunology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade de S Exceptiono Paulo, s Exceptiono Paulo, SP, Brasilien.
3Disciplina av allergi, immunologi och reumatologi, Institutionen för pediatrik, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de S Exceptiono Paulo, s Exceptiono Paulo, SP, Brasilien.
4laborat uzirio medicinsk forskning 56, Institutionen för dermatologi, Medicinska fakulteten,, Universidade de S usci Paulo, s usci Paulo, SP, Brasil
Abstrakt introduktion patienter och metoder resultat diskussion bekräftelser korrespondens och fotnoter
Abstrakt 
kronisk granulomatös sjukdom (CGD) är en ärftlig störning i det medfödda immunsystemet som kännetecknas av en defekt oxidativ burst av fagocyter och efterföljande försämring av deras mikrobicida aktivitet. Mutationer i en av NADPH-oxidas-komponenterna påverkar genuttryck eller funktion av detta system, vilket leder till fenotypen av CGD. Defekter i gp91-phox leder till X-länkad CGD, ansvarig för cirka 70% av CGD-Fallen. Undersökning av den mycket heterogena genotypen av CGD-patienter inkluderar mutationsanalys, Northern blot eller Western blot-analyser enligt det specifika fallet. Syftet med denna studie var att använda omvänd transkription (RT)-PCR för analys av molekylära defekter som är ansvariga för X-länkad CGD hos åtta brasilianska patienter och att bedöma dess potential för bredare tillämpning på molekylär screening i CGD. Totalt RNA framställdes från Epstein B-virustransformerade B-lymfocyter och omvänt transkriberades med användning av slumpmässiga hexamers. Den resulterande cDNA förstärktes PCR av specifika och överlappande par av primers utformade för att förstärka tre regioner av gp91-phox-genen: exoner 1-5, 3-9 och 7-13. Denna strategi upptäckte defekt gp91-phox-uttryck hos sju patienter. RT-PCR-resultaten matchade klinisk historia, biokemiska data (nitroblue tetrazolium eller superoxidfrisättningsanalys) och tillgänglig mutationsanalys i fyra fall. I ytterligare tre fall matchade RT-PCR-resultat klinisk historia och biokemiska data. I ett annat fall var RT-PCR normalt trots en klinisk historia kompatibel med CGD och defekt andningsbrist. Vi drar slutsatsen att denna nya tillämpning av RT-PCR – analys – en enkel, ekonomisk och snabb metod-var lämplig för screening av molekylära defekter hos 7 av 8 X-länkade CGD-patienter.
nyckelord: superoxid, fagocyter, primär immunbrist, respiratorisk burst, neutrofiler, Human
introduktion
kronisk granulomatös sjukdom (CGD) är en primär immunbrist som ursprungligen beskrivits 1957 som en klinisk enhet som påverkar manliga spädbarn och namnges vid den tiden dödlig granulomatös sjukdom i barndomen. De viktigaste egenskaperna hos CGD är återkommande och allvarliga infektioner som involverar organismens naturliga barriärer, såsom luftvägarna och lymfkörtlarna, och så småningom inre strukturer som levern, mjälten, benen och hjärnan (1-3). Den uppskattade förekomsten av denna sällsynta sjukdom är 1/250 000 levande födda per år. Infektionerna orsakas generellt av katalasnegativa bakterier såsom Staphylococcus aureus, gramnegativa baciller och svamparter som Aspergillus, Candida och Nocardia (4,5).
NADPH-oxidassystemet genererar superoxid och andra reaktiva syreintermediärer, avgörande för den mikrobicida aktiviteten hos fagocyter. Den biokemiska defekten i CGD är en försämring av NADPH-oxidasaktivitet och efterföljande oförmåga att förstöra mikroorganismer (6). Huvudkomponenterna i NADPH-oxidas-systemet är gp91-, p22-, p47-, p67-och p40-phox. Molekylära defekter som orsakar CGD beror i allmänhet på frånvaro, lågt uttryck eller funktionsfel hos en av NADPH-oxid-komponenterna. Den X-länkade formen av denna sjukdom orsakas av defekter i gp91-phox, den tunga kedjan av cytokrom b588, och står för cirka 70% av alla fall (7,8). De autosomala recessiva formerna orsakas av defekter i en av de cytosoliska komponenterna i NADPH – oxidas (p47-eller p67-phox, respektive i 20 och 5% av fallen) eller cytokrom b588 lättkedjekomponent (p22-phox, 5% av fallen) (9,10). CGD är ett mycket heterogent tillstånd: över 300 mutationer har registrerats i en internationellt underhållen X-CGD-databas (8). Mutationerna har distribuerats till stor del inom de 13 exonerna eller vid exon/intron-gränserna för gp91-phox (CYBB) – genen och nästan 200 av dessa mutationer är unika.
diagnosen av CGD baseras generellt på sjukdomens kliniska egenskaper plus defekt NADPH-oxidasaktivitet som demonstreras av onormal nitroblue tetrazolium (NBT), dihydrorhodamin 123 eller superoxidfrisättningsanalyser (11,12). I det stimulerade NBT-testet visar normala individer nästan 100% positiva celler, medan i CGD-patienter är färre än 5% av cellerna positiva (13). Dessutom är celler från patienter med variant CGD positiva, men visar endast mycket låg aktivitet (6). NBT-testet upptäcker också bärarna av X-länkad CGD (mödrar och systrar). En definitiv molekylär CGD-diagnos fastställs hos patienter med ett onormalt NBT-test eller andningsaktivitet som har en av följande egenskaper: en mutation i gp91 -, p22 -, p47-eller p67-phox; frånvarande mRNA för en av dessa gener detekterade genom Northern blot-analys; och/eller frånvarande protein för en av dessa oxidasskomponenter av Western blot. En genetisk, men inte molekylär, diagnos kan fastställas genom demonstration av moderns kusiner, farbröder eller syskonbarn med en onormal NBT-test eller andnings burst (14). Således kräver upprättandet av en definitiv diagnos av denna sällsynta och mycket heterogena sjukdom komplexa och dyra metoder såsom en kombination av Northern blot eller Western blot och single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP) följt av DNA-sekvensering av flera familjemedlemmar, alla utförda i forskningslaboratorier med hög komplexitet.
metoden för omvänd transkription-PCR (RT-PCR) innefattar amplifiering av cDNA med PCR. Denna teknik kan enkelt standardiseras i mindre sofistikerade laboratorier. Det ger information om genuttryck och preliminära data om strukturen eller storleken på mRNA hos den defekta komponenten. RT-PCR har sällan använts i CGD-forskning, begränsad till patofysiologiska studier (15-29). Hittills har den potentiella användningen av detta användbara verktyg för att fastställa den definitiva diagnosen X-länkad CGD, den vanligaste formen, inte undersökts i stor utsträckning. Syftet med denna studie var att utvärdera användningen av RT-PCR för screening av molekylära defekter som är ansvariga för X-länkad CGD, en sällsynt och eventuellt feldiagnostiserad immunbrist, hos åtta brasilianska patienter.
patienter och metoder
patienter
studien inkluderade 8 orelaterade manliga brasilianska patienter med sannolik X-länkad CGD (2 svarta och 6 Kaukasier; ålder 2-8 år; höjd 88-108 cm; vikt 11-19 kg). Patienterna presenterade kliniska historier om återkommande allvarliga infektioner såsom lunginflammation, lymfadenit, leverabscess, pyodermit och biverkningar på BCG-immunisering. De hänvisades till vårt laboratorium för biokemisk och molekylär diagnostisk utvärdering. Skriftligt informerat samtycke erhölls från deltagarna före studien. Medicinska skolans Etikutskott godkände protokollet i enlighet med Helsingforskonventionen och Brasiliens hälsoministerium, Resolution 196/96.
biokemisk diagnos av CGD
den biokemiska diagnosen av CGD fastställdes enligt Pan American Group for Immunodeficiencies criteria. En försämring av NADPH-oxidasaktivitet demonstrerades genom NBT-glidtestet och / eller superoxidanjonfrisättningsanalysen av perifera blodneutrofiler och mononukleära leukocyter (14,30,31). Neutrofiler och mononukleära leukocyter erhölls genom centrifugering av blodprover över en Ficoll-Hypaque densitetsgradient (32).
NBT-glidtestet baserades på reduktionen av NBT till formazan med aktiverade leukocyter (31). Analysen utfördes som tidigare beskrivits (30). Mer än 95% av 200 normala neutrofiler stimulerade med 30 nM phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) bör kunna minska NBT. Frånvarande reaktion eller <5% positiva celler ansågs indikera en diagnos av CGD (14).
kvantitativ superoxidfrisättning med neutrofiler och mononukleära leukocyter bedömdes med en modifierad superoxiddismutashämmande cytokrom C-reduktionsanalys (33-35). Mängden frisatt superoxid beräknades med användning av en utrotningskoefficient på 0,21 nM/cm för cytokrom c. resultaten rapporteras som nmol superoxid frisatt av 106 celler per timme. Patienter med CGD visade mindre än 10% av kontrollvärdena.
Screening av molekylära defekter som är ansvariga för X-länkad CGD
B-lymfocyter från X-länkade CGD-patienter transformerades in vitro med Epstein B-virus (EBV) (15,16) för att ge en riklig källa till nukleinsyror för molekylära studier. De EBV-transformerade B-cellinjerna reproducerar de biokemiska och molekylära defekterna hos CGD-patienter (15,16,36) och eliminerar behovet av upprepade blodsamlingar. I korthet odlades perifera blodleukocyter från X-länkade CGD-patienter med supernatanter från B95-8, en EBV-producentcellinje (15,16,36,37), i rpmi 1640-medium kompletterat med värmeinaktiverat fetalt bovint serum (10%), 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 accug/ml streptomycin, vid 37 ACCUCC, i en fuktig atmosfär med 5% CO2. Cellens livskraft övervakades och kulturerna bibehölls under hela studieperioden.
RNA-prover från EBV-transformerade B-cellinjer framställdes med guanidin HCl-metoden, följt av etanolutfällning och kvantifiering med standardmetoder (38,39). CDNA-proverna erhölls genom omvänd transkription av 2 ACC Total RNA med SuperScript II RT (GIBCO BRL) och slumpmässiga hexamers (15). Kvaliteten på mRNA-proverna kontrollerades genom PCR-amplifiering av Bisexuell-aktin, en konstitutiv genkontroll (bp 920-943 och bp 1494-1471) (Gen Bank anslutning nr. NM001101).
gp91-phox-genuttryck bedömdes med RT-PCR. Specifika och överlappande par primers (Gen Bank anslutning nr. Nm_000397, Tabell 1) användes för att förstärka (30 cykler) tre gp91-phox exoniska regioner: 1-5, 3-9 och 7-13. Denna strategi tillät oss att screena alla gp91-phox exoner. PCR-produkter analyserades med 2% agarosgelelektrofores och färgades med etidiumbromid.
relativt gp91-phox-genuttryck analyserades med Image Master-programvaran (Pharmacia-Biotech). Densitometri-resultatet för målprover dividerades med densitometri-resultatet av Avsugning-aktin, en konstitutiv genkontroll, normalisering av den nivå som övervägs för analys. Resultaten av RT-PCR-analyser jämfördes med patientens kliniska historia, biokemiska analyser (NBT-och / eller superoxidfrisättningsanalys) och tillgängliga mutationsanalysdata (http://www.sbi.org.br/Sbi2003/ index.htm).
resultat
vi studerade 8 manliga patienter med kliniska historier om återkommande allvarliga infektioner, hänvisade till vårt laboratorium för biokemisk och molekylär diagnos av CGD. Resultaten av NBT-glidtesterna och superoxidfrisättningsanalyserna visas i Tabell 2. Sex av patienterna presenterade mindre än 5% positiva leukocyter i NBT-glidtestet. Sex patienter visade nedsatt superoxidfrisättning av granulocyter och / eller mononukleära leukocyter (mindre än 10% jämfört med friska kontroller). Fyra patienter hade onormala resultat i båda testerna. Alla patienter presenterade minst ett onormalt test och fick diagnosen sannolik X-länkad CGD. Mamman och syster till patienten T. B. P. presenterade ett NBT-glidtest som är kompatibelt med bärarstatusen för X-länkad CGD. Under studieperioden dog en patient (G. M.) av lunginflammation.
vi undersökte därefter den definitiva diagnosen av X-länkad CGD genom RT-PCR-analys av gp91-phox-genuttryck. Resultaten av RT-PCR-amplifiering med tre uppsättningar överlappande primers presenteras i Tabell 2. Kvaliteten på mRNA-provet kontrollerades genom PCR-amplifiering av Bisexuell-aktin, en konstitutiv genkontroll. De förväntade normala produkterna erhölls i detta fall (figurerna 1, 2 och 3).
i fyra fall var det möjligt att matcha RT-PCR-data med tillgänglig mutationsanalys, presenterad på annat håll av Pati Excepico et al. (30) eller av vår grupp ( //www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. presenterade en c469 t-övergång i T exon 5, förutsäga en nonsensmutation (R157X). M. F. presenterade en nonsensersättning i exon 3, R (arginin) 73-Stop. R. S. visade en 264 G av en substitution vid 3′-skarvkorsningen av gp91-phox exon 3. CDNA-sekvensen visade en deletion av gp91-phox exon 3, vilket gav upphov till en instabil eller icke-funktionell mutant gp91-phox. G. G. presenterade en defekt skarvning av gp91-phox exon 3 (den underliggande mutationen har ännu inte fastställts). De andra patienterna fortsätter att undersökas.
som helhet tillät denna strategi detektering av defekt gp91-phox-uttryck hos sju av åtta patienter. RT-PCR-resultaten matchade klinisk historia, biokemiska data (NBT-eller superoxidfrisättningsanalys) och tillgänglig mutationsanalys i fyra fall. I ytterligare tre fall matchade RT-PCR-resultat klinisk historia och biokemiska data. I ett annat fall var RT-PCR normalt trots en klinisk historia kompatibel med CGD, en defekt respiratorisk burst kännetecknad av NBT-testet och superoxidfrisättningsanalysen och NBT-test av sin mor och syster kompatibel med X-länkad CGD-bärarstatus.
diskussion
detta dokument rapporterar om biokemiska och genuttrycksstudier av 8 orelaterade brasilianska manliga patienter med klinisk historia av CGD, som hänvisades till vårt laboratorium för detaljerad undersökning. CGD är en sällsynt ärftlig sjukdom där fagocytiska celler inte kan generera superoxidanjon och andra reaktiva syreintermediärer. Vi fastställde initialt diagnosen av sannolik X-länkad CGD med hjälp av biokemiska metoder såsom NBT-glidtest och/eller superoxidanjonfrisättningsanalyser. Våra resultat visade att alla patienter uppvisade nedsatt NADPH-oxidasfunktion och i sin tur sannolik X-länkad CGD.
båda metoderna bidrar till den sannolika diagnosen CGD på olika sätt. NBT-glidtestet ger information om antalet celler som reducerar NBT till formazan inuti cytoplasman och intensiteten av denna reduktion. Således visar patienter med variantformer av X-länkad CGD onormala NBT-glidtest, där de flesta cellerna svagt reducerar NBT till formazan. NBT-glidtestet upptäcker också kvinnliga bärare av X-länkad CGD. Superoxidfrisättningsanalysen mäter reduktionen av cytokrom c med superoxid producerad av aktiverade leukocyter närvarande i reaktionen, vilket möjliggör diagnos av variantformer av X-länkad CGD. Båda testerna kan enkelt standardiseras i laboratorier med låg komplexitet och varken kräver dyr utrustning. Dihydrorhodamine 123-testet är en mycket känslig metod för biokemisk diagnos av CGD; det kräver emellertid en flödescytometer, ett mycket dyrt instrument.
vi utvärderade gp91-phox-genuttryck i EBV-transformerade B-lymfocyter från CGD-patienter genom RT-PCR-analys. Specifika och överlappande par av primers användes för att förstärka tre regioner av gp91-phox-genen med RT-PCR: exoner 1-5, 3-9 och 7-13. Denna strategi möjliggjorde detektering av defekt gp91-phox-uttryck hos 7 av 8 patienter. RT-PCR-resultaten matchade klinisk historia, biokemiska data (NBT-eller superoxidfrisättningsanalys) och tillgänglig mutationsanalys i fyra fall. I ytterligare tre fall matchade RT-PCR-resultat klinisk historia och biokemiska data.
gp91-phox-genuttryck reducerades i alla exoniska regioner av patient R. B. denna reduktion kan vara resultatet av mutationer som leder till låg RNA-stabilitet eller förändrad transkriptionsaktivitet. Patienter G. M. och T. P. visade frånvarande uttryck av exoner 7-13, vilket tyder på att det minskade uttrycket av dessa ytterligare 3′-end exoner kan vara resultatet av RNA-instabilitet eller en skarvningsdefekt, t.ex. delvis korrekt skarvning för att producera en signal, men delvis onormal skarvning för att eliminera ett primerbindningsställe, ett ämne som ska undersökas av framtida genomiska DNA-mutationsanalyser.
Patient G. G. presenterade en diffus, låg överflöd, mindre produkt av exoner 1-5 (Figur 1) och frånvarande uttryck av andra exoniska regioner. Hans mutationsanalys visade en defekt på exon 3-skarvplatsen. På liknande sätt avslöjade mutationsanalysen av patient R. S. också en defekt vid exon 3-skarvplatsen. I detta fall kunde emellertid en mindre riklig PCR-produkt detekteras.
Patient M. F. presenterade reducerat uttryck av exoniska regioner 3-9 och 7-13, vilket kan vara resultatet av defekt transkriptionsaktivitet i exon 3. J. E. M. presenterade en nonsensmutation i exon 5 som resulterade i förlust av gp91-phox-uttryck, vilket framgår av RT-PCR-analys, en möjlig konsekvens av nonsensmedierad mRNA-instabilitet.
i ett fall, patient T. P. B., gp91-phox-genuttryck var normalt trots en familjehistoria kompatibel med CGD och en defekt respiratorisk sprängaktivitet. I detta fall var diagnosen sannolik X-länkad CGD baserad på onormala NBT-tester hos sin mor och hans syster, kompatibel med bärarstatus. Vi antar att en punktmutation, såsom en enda bassubstitution som inte ändrar PCR-fragmentlängd eller överflöd, bör undersökas i detta speciella fall.
RT-PCR är ett kraftfullt verktyg för att bedöma genuttryck. Denna egenskap kan delvis förklara variationen i gp91-phox-genuttryck bland patienterna som ingår i denna studie och vikten av att kombinera överlappande par primers för att screena meddelandets fulla längd. RT-PCR har använts i isolerade fallstudier som en del av den initiala diagnosen av de olika formerna av CGD (17-22). RT-PCR-analys var också användbar vid prenatal diagnos av CGD, som härrör från p47-phoxbrist (23). Det har emellertid oftare använts för studier av genreglering av NADPH-oxidas-komponenterna i en mängd olika celler (15,16,24-29). Hittills har den potentiella användningen av detta användbara verktyg för att fastställa den definitiva diagnosen X-länkad CGD, den vanligaste formen, inte undersökts i stor utsträckning. Ytterligare studier bör utföras för att jämföra känsligheten och specificiteten hos detta test jämfört med andra komplexa analyser såsom västra eller Norra blottar.
Sammantaget har vi visat att RT-PCR, en enkel och lågkostnadsmetodik, etablerade den definitiva diagnosen av X-länkad CGD i 7 av 8 fall, utan att behöva använda komplexa och dyra metoder som Northern blot, slot blot, SSCP-analys eller genomisk DNA-sekvensering. Således kan RT-PCR vara ett lämpligt verktyg för att diagnostisera CGD i laboratorier i utvecklingsländer. Det är mycket viktigt att bestämma den definitiva molekylärgenetiska defekten för att ge lämplig genetisk rådgivning och prognos för kindreds med CGD. Dessutom kommer molekylärgenetiska studier av det mänskliga NADPH-oxid-systemet att främja kunskapen om denna viktiga och antika försvarsmekanism.
2. Landning BH & Shirkey HS (1957). Ett syndrom av återkommande infektion och infiltrering av inälvorna av pigmenterade lipidhistiocyter. Pediatrik, 20: 431-442.
3. Patterson EL, Milstrey r & Stokstad ELR (1975). Effekt av selen för att förebygga exudativ diatese hos kycklingar. Förfaranden från Society for Experimental Biology and Medicine, 95: 617-620.
5. Forrest CB, Forehand JR, Axtell RA, Roberts rl & Johnston Jr RB (1988). Kliniska egenskaper och nuvarande hantering av kronisk granulomatös sjukdom. Hematologi / onkologikliniker i Nordamerika, 2: 253-266.
6. Curnutte JT (1993) (på engelska). Kronisk granulomatös sjukdom: lösningen av en klinisk gåta på molekylär nivå. Klinisk immunologi och Immunopatologi, 67: S2-S15.
7. Dinauer MC, Orkin SH, brun R, Jesaitis aj & Parkos CA (1987). Glykoproteinet kodat av den X-länkade kroniska granulomatösa sjukdomsplatsen är en komponent i det neutrofila cytokrom B-komplexet. Natur, 327: 717-720.
9. Clark RA, Malech HL, Gallin JI, Nunoi H, Volpp BD, Pearson DW, illamående WM & Curnutte JT (1989). Genetiska varianter av kronisk granulomatös sjukdom: förekomst av brister i två cytosoliska komponenter i NADPH-oxid-systemet. New England Journal of Medicine, 321: 647-652.
10. Jag är en av de mest kända i världen. & Heyworth PG (2000). Hematologiskt viktiga mutationer: de autosomala recessiva formerna av kronisk granulomatös sjukdom (första uppdateringen). Blodceller, molekyler och sjukdomar, 26: 561-565.
11. Smith RM & Curnutte JT (1991). Molekylär grund för kronisk granulomatös sjukdom. Blod, 77: 673-686.
12. Vowells SJ, Fleisher TA, Sekhsaria S, Alling DW, Maguire TE & Malech HL (1996). Genotypberoende variation i flödescytometrisk utvärdering av reducerad nikotinamidadenindinukleotidfosfatoxidasfunktion hos patienter med kronisk granulomatös sjukdom. Journal of Pediatrics, 128: 104-107.
15. Condino-Neto a & Newburger PE (1998). NADPH-oxidasaktivitet och cytokrom b558-innehåll av humant Epstein-Barr-virus transformerade B-lymfocyter korrelerar med uttryck av gener som kodar för komponenter i oxid-systemet. Arkiv för biokemi och biofysik, 360: 158-164.
16. Condino-Neto a & Newburger PE (2000). Interferon-gamma förbättrar skarvningseffektiviteten hos CYBB-genavskrifter i en interferonresponsiv variant av X-länkad kronisk granulomatös sjukdom på grund av en konsensus-regionmutation i skarvstället. Blod, 95: 3548-3554.
19. Bonizzato A, Russo MP, Donini m & Dusi S (1997). Identifiering av en dubbel mutation (D160V-K161E) i p67phox-genen hos en patient med kronisk granulomatös sjukdom. Biokemisk och biofysisk forskningskommunikation, 231: 861-863.
21. Noack D, Heyworth PG, Newburger PE & korsa AR (2001). En ovanlig intronisk mutation i CYBB-genen som ger upphov till kronisk granulomatös sjukdom. Biochimica et Biophysica Acta, 1537: 125-131.
22. Roesler J, Curnutte JT, Rae J, Barrett D, Patino P, Chanock sj & Goerlach A (2000). Rekombinationshändelser mellan P47-phox-genen och dess mycket homologa pseudogener är den främsta orsaken till autosomal recessiv kronisk granulomatös sjukdom. Blod, 95: 2150-2156.
23. De Boer M, Singh V, Dekker J, Di Rocco M, Goldblatt D & Roos D (2002). Prenatal diagnos i två familjer med autosomal, P47(phox)-bristfällig kronisk granulomatös sjukdom på grund av en ny punktmutation i NCF1. Prenatal Diagnos, 22: 235-240.
24. Baehner RL, Millar-Groff s & Bringas P (1999). Utvecklingsuttryck av NADPH-fagocytiska oxidaskomponenter i musembryon. Pediatrisk Forskning, 46: 152-157.
25. Banerjee R, Anguita J, Roos D & Fikrig E (2000). Skäregg: infektion av medlet av humant granulocytisk ehrlichiosis förhindrar andningsbrist genom nedreglerande gp91phox. Journal of Immunology, 164: 3946-3949.
26. Bayraktutan U, Blayney l & Shah AM (2000). Molekylär karakterisering och lokalisering av nad(P)h oxidas komponenter gp91-phox och p22-phox i endotelceller. Arterioskleros, trombos och vaskulär biologi, 20: 1903-1911.
27. Cobbs S, Malech HL, Leto TL, Freeman SM, Blaese RM, Gallin ji & Lomax KJ (1992). Retroviralt uttryck av rekombinant p47phox-protein med Epstein-Barr-virustransformerade B-lymfocyter från en patient med autosomal kronisk granulomatös sjukdom. Blod, 79: 1829-1835.
28. Gorlach A, Brandes RP, Nguyen K, Amidi M, Dehghani f & Busse R (2000). En gp91phox innehållande NADPH-oxidas selektivt uttryckt i endotelceller är en viktig källa till syreradikalgenerering i artärväggen. Cirkulationsforskning, 87: 26-32.
29. Rouzaut A, Lopez-Moratalla n & de Miguel C (2000). Differentiellt genuttryck vid aktivering och mognad av humana monocyter. Arkiv för biokemi och biofysik, 374: 153-160.
31. Ochs HD & Igo RP (1973). NBT slide test: en enkel screeningmetod för att upptäcka kronisk granulomatös sjukdom och kvinnliga bärare. Journal of Pediatrics, 83: 77-82.
32. Boyum A (1968). Isolering av mononukleära celler och granulocyter från humant blod. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 21 (Suppl 97): 1-77.
33. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1993). Neutrofiler och mononukleära celler från patienter med kronisk granulomatös sjukdom frisätter kväveoxid. British Journal of Clinical Pharmacology, 35: 485-490.
35. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Bellinati-Pires R, Brandao AC, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1996). Effekten av rekombinant human interferon-gammabehandling på neutrofil och mononukleär cell kväveoxidfrisättning från patienter med kronisk granulomatös sjukdom. Tidskrift för Interferon och Cytokinforskning, 16: 357-364.
36. Volkman DJ, Buescher ES, Gallin ji & Fauci AS (1984). B – cellinjer som modeller för ärftliga fagocytiska sjukdomar: superoxidgenerering vid kronisk granulomatös sjukdom och granuler i Chediak-Higashi syndrom. Journal of Immunology, 133: 3006-3009.
37. Nilsson K, Klein G, Henle W & Henle G (1971). Inrättandet av lymfoblastoidcellinjer från vuxen och fetal Human lymfoid vävnad och dess beroende av EBV. International Journal of Cancer, 8: 443-450.
39. Subrahmanyam YVBK, Baskaran N, Newburger PE & Weissman SM (1999). En modifierad metod för visning av 3′-end restriciton fragment av cDNA: molekylär profilering av genuttryck i neutrofiler. Metoder i enzymologi, 303: 272-297.
bekräftelser
författarna tackar patienterna och deras familjer för att delta och för deras hjälp, och sjuksköterskan Silvana Severino för teknisk hjälp. Författarna tackar också professor Peter Newburger, University of Massachusetts Medical School, för en kritisk granskning av detta manuskript.
korrespondens och fotnoter