isoleringen och långsiktig expansion av primära celler, särskilt stam/stamfaderpopulationer, är grundläggande och viktiga grundläggande tekniker inom olika biologiska områden, inklusive utvecklingsbiologi och stamcellsbiologi och medicinsk vetenskap. Celler i stratifierade och kolumnar epitelvävnader är mycket regenerativa och oproportionerligt ansvariga för många mänskliga cancerformer; kloning av vuxna stamceller begränsas emellertid av svårigheter att upprätthålla dessa celler i ett omoget tillstånd. Under de senaste åren har tekniska innovationer resulterat i snabba och dramatiska framsteg inom stamcellsbiologi, såsom användning av små molekyler och tillväxtfaktorer för att efterlikna vävnadsnischmiljöer och underlätta ”Organoidkultur” .
1975 etablerade Rheinwald och Green det första framgångsrika exemplet på mänsklig stamcellskultur med mänskliga keratinocyter . Specifikt upprätthöll de humana keratinocyter på lång sikt i kombination med en subletalt bestrålad musfibroblastcellinje, 3T3-J2. Även om de inte använde termen ”stamceller” för klonade keratinocyter odlade på 3T3-celler, hittade Green och kollegor kolonier med den anmärkningsvärda förmågan att dela upp och bilda nya kolonier efter passage, som de kallade ”Holoclones” . Dessa holokloner består av små, omogna celler som alla uppvisade intensiv kärnfärgning med p63, en huvudregulator för stamhet, i stratifierade epitelceller . I det stratifierade epitelet, inklusive hud, lungbronki, bröstkörtel och urinblåsans urotel, var stamcellspopulationen huvudsakligen lokaliserad i basskiktet och omogna celler färgades med p63, i överensstämmelse med in vitro-studierna . Signifikant har isolerade och expanderade humana keratinocyter från autolog hud framgångsrikt ympats för att bränna patienter och regenererat en permanent epidermis som liknar det som härrör från hudtransplantat med delad tjocklek . I synnerhet har samma procedur tillämpats för att isolera och expandera humana hornhinnepitelceller för transplantation . Även om denna teknik var begränsad till stamceller i epidermis och hornhinna vid den tiden skapade Green och kollegor grunden för kloning av mänskliga vuxna stamceller inom områdena grundläggande biologi och regenerativ medicin.
i denna översiktsartikel ger vi en översikt över senaste forskningsframsteg och ackumulerande bevis på ett cellodlingssystem som har lett till tekniska genombrott i epitelcellsteknologier. Nya odlingsstrategier för både stratifierade epitelceller och kolumnerade epitelceller har gjort det möjligt för mänsklig epitelutveckling att rekapituleras och kan användas för att generera en human sjukdomsmodell in vitro. Vi diskuterar också potentiella och möjliga tillämpningar av normal epitelcellodlingsteknik för regenerativ medicin och belyser ett cancercellodlingssystem som reproducerar enskilda patientfenotyper.
stratifierad epitelcellskultur
i stratifierade epitelvävnader, inklusive glandulärt och pseudostratifierat epitel, kan p63+-celler, som är lokaliserade på källarmembranet, förnya sig för att upprätthålla stam/stamfader populationer och ge upphov till avkommor som bildar funktionella vävnader . Som nämnts ovan har kloning och expansion av epitelstamceller, såsom hudkeratinocyter och hornhinnepitelceller, varit väl etablerade i samodlingssystem med bestrålade mus 3T3-J2 fibroblaster. Detta standardprotokoll har emellertid till stor del begränsats till den långsiktiga kulturen av keratinocyter och hornhinneceller. Icke desto mindre har klonade stamceller från tymisk epitel rapporterats, liksom isoleringen av tymiska epitelstamceller från olika arter, inklusive mänskliga celler, odlade med ett 3T3-matarsystem . Dessutom använde Frey och kollegor nyligen 3T3-matarmetoden för att isolera uroteliala stamceller som uttryckte sonic hedgehog och bodde i basalskiktet i urinblåsans urotel . Dessa uroteliala stamceller från isolerad mänsklig och svinvävnad odlades stabilt på ett 3T3-matarskikt och kunde ge upphov till flera celllinjer, inklusive p63+ basala celler och Uroplakin 2+ och 3+ uroteliala celler, efter njurkapseltransplantation i nakna möss. I 2011, Pooja et al. utnyttjade 3T3-odlingssystemet för att isolera tre typer av humana luftvägsepitelstamceller, dvs. och distala luftvägsstamceller, och fann att dessa luftvägsepitelstamceller uppvisade distinkta cellulära fenotyper efter in vitro-differentiering, även om de omogna stamcellsklonerna tycktes vara morfologiskt oskiljbara (Fig. 1) . I en uppföljningsstudie visade transplantationen av epitelceller från mustrakeal och distala luftvägar att distala luftvägsstamceller lätt införlivades i H1N1 influensaskadad lungvävnad och differentierades till flera epitelcellstyper, dvs., bronkioler och alveoler, medan transplanterade trakeala stamceller lokaliserades endast i större luftvägar . Klonogena stamceller isolerades också från endoskopiska biopsiprover i matstrupen, och dessa celler kunde bilda väl differentierade, stratifierade skivepitelliknande strukturer i ett luftvätskegränssnitt (ALI) odlingssystem .
schematisk av cellodlingsprocessen för humana stratifierade och kolumna epitelstamceller på ett 3T3-musmatarskikt. För stratifierade epitelstamceller isoleras de från biopsi eller kirurgiska prover pläteras på ett 3T3-lager för en långsiktig kultur. För kolumnar epiteliala stamceller pläteras de på ett 3T3-lager med definierade faktorer som är väsentliga för stamcellstillväxt och underhåll. Morfologiskt omogna kolonier (packade kolonier med små celler) av epitelstamceller plockas mekaniskt upp för ytterligare homogen expansion. I ALI-kulturen genomgår cellerna differentiering till mogna celltyper i en Transwell
Schlegel och kollegor rapporterade att en Rho-associerad proteinkinas (ROCK) – hämmare i kombination med 3T3-matarceller ökade signifikant den proliferativa kapaciteten hos epitelstamceller, inklusive humana keratinocyter, prostataceller och bröstkörtelceller, och de kallade detta fenomen ”villkorlig omprogrammering” . Förmågan att effektivt generera epiteliala stamcellskulturer från patienter ger kritiska och värdefulla insikter i cellbaserad diagnostik och terapi . På senare tid visade Rajagopal och kollegor att signalvägen för TGF 2/BMP/SMAD är viktig i olika epitelvävnader, inklusive ektoderm-härledd hud-och bröstkörtelvävnad, endoderm-härledd matstrupe och prostatavävnad och mesoderm-härledd epididymis. De upptäckte att den dubbla inhiberingen av SMAD-signalering (BMP-signalen blockerades av DMH-1 och TGF-Bordssignalen inhiberades av A-83-01) underlättade den stabila förökningen av humana och Muse epiteliala basalcellspopulationer. Överraskande möjliggjorde dubbel TGF-inhibering av TGF / BMP den robusta expansionen av epitelstamceller utan behov av mus 3T3-matarceller.
sammantaget kan dessa tekniska framsteg, i kombination med små molekyler och matarceller, användas för att kontinuerligt och effektivt expandera stratifierade epitelstam/stamfader populationer in vitro. Ett annat genombrott i stratifierad epitelkultur, organoidkultur, har använts för att expandera både basala och luminala humana prostataförfäder. Dessa humana luminala stamfäder var multipotenta och bildade prostatakörtelliknande strukturer in vitro . Att generera tredimensionella strukturer bestående av stratifierad eller pseudostratifierad epitel för att rekapitulera autentisk in vivo-arkitektur förblir emellertid utmanande, även om många forskare har rapporterat sfäroid-och organoidkulturer. Detta problem kan lösas genom att upprätta en metod för att underlätta självorganisering, som utförs i pluripotenta stamcell härledda vävnader .
Columnar epithelial Cell culture
även om intestinala stamceller har den anmärkningsvärda förmågan att proliferera med hög omsättningshastighet för att upprätthålla tarmepitel och hepatocyter är mycket regenerativa som svar på skador, är förmågan att klona stamcellspopulationer från kolumna epitelceller kraftigt begränsad, förmodligen på grund av brist på vävnadsnischsignaler in vitro. Under det senaste decenniet upptäckte Clevers och kollegor LGR5 (leucin-rich repeat-innehållande G-protein coupled receptor 5), en intestinal stamcellsmarkör, i en sofistikerad musmodell (Lgr5-EGFP-ires-CreERT2-möss korsade med den Cre-aktiverade Rosa26 LacZ reporter) och etablerade en mustarmorganoidkulturmetod som består av villusliknande strukturer och kryptliknande zoner med flera tarmcelltyper . I kombination med tillväxtfaktorer och småmolekylära cocktails suspenderades en isolerad lgr5+ stamcellsfraktion i Matrigel och odlades på lång sikt . Genom att modifiera odlingstillståndet med användning av nikotinamid, en P38-och TGF-Receptorinhibitor, kunde humana epitelceller isolerade från tunntarmen och tjocktarmen oändligt expandera långsiktigt in vitro . Denna teknik är tillämplig på odling av andra typer av celler, såsom bukspottkörtelkanalceller och hepatocyter , och underlättade revolutionerande framsteg inom kolumnär epitelcellodling.
Organoidkultur använder en Matrigelbaserad 3D-kulturplattform och kan i stor utsträckning användas för att stabilt odla olika typer av vuxna epitelceller, inklusive stratifierade epitelceller, med stam – /stamcellspopulationer . Förmågan att snabbt och effektivt sprida en bråkdel av enhetliga stamceller in vitro är emellertid också användbar och viktig för den detaljerade studien av självförnyelse och ödespecifikation i vävnadsstamceller och möjliga framtida tillämpningar av celltransplantation för regenerativ medicin. Xian och kollegor utvecklade nyligen ett nytt kultursystem för homogen expansion av humana fetala intestinala stamceller, inklusive tunntarmen och kolonceller. Detta system använde ett 3T3-musmatarskikt i kombination med tillväxtfaktorer och signalvägshämmare för att kraftigt expandera mänskliga kolumnar epitelstamceller (Fig. 1) . Dessutom kunde mer än 50% av intestinala stamceller odlade på 3T3 fibroblaster bilda kolonier. I däggdjurstarmen är definierade nischfaktorer, såsom WNT-och Notch-signaler, väsentliga för att styra stammen hos intestinala stamceller vid kryptbasen. Vidare uppstår Panethceller, som också är belägna vid kryptbasen, från stamceller och fungerar som stamcellsnischen genom att tillhandahålla väsentliga faktorer på ett parakrin sätt. Eftersom organoidkulturer består av stamceller och olika derivat, såsom Panetceller, levereras nischfaktorer autonomt . Däremot, eftersom en ren population av intestinala stamceller odlas på ett 3T3-matarlager, kan cellerna inte utsöndra nischfaktorer. Därför måste extrinsiska faktorer som liknar nischfaktorer kompletteras. Förutom stamcellsunderhållsprotokollet har ett differentieringsprotokoll etablerats i en ALI-odlingsmodell för att ge upphov till minst fyra typer av större tarmceller, dvs Panethceller, entero-endokrina celler, bägarceller och enterocyter (intestinala absorberande celler) . Bildandet av intestinala villusliknande strukturer observerades enligt de ursprungliga vävnadstyperna, sådana tunntarms-och tjocktarmsvävnader (Fig. 1). I en annan ALI-kulturinriktning odlade Kuo och kollegor robust små bitar av mus neonatal tarm med ett stromalt element på lång sikt .
samma strategi tillämpades också för att klona humana gastriska stamceller erhållna från endoskopisk biopsi. Specifikt utvidgades klonogena magceller stabilt på ett 3T3-matarskikt i kombination med tillväxtfaktorer och små molekyler och differentierades till gastriska epitellinjer som vanligtvis finns i magen, såsom pepsinogen-Uttryckande huvudceller . Förutom klonade matsmältningsorganstamceller kunde oviduktprogenitorceller från det distala livmoderröret också oändligt föröka sig på ett 3T3-matarskikt i närvaro av nischfaktorer . Den distala ovidukten, fimbria epitel, är ett enkelt kolumnerat epitelskikt som består av följande två typer av celler: cilierade celler, som förbättrar transporten av gameter och sekretoriska celler, som utsöndrar slem. Med hjälp av en liten modifiering av differentieringsprotokollet för intestinala stamceller gav långsiktiga ALI-odlade oviduktala stamceller upphov till en 3D-arkitektur, innehållande både cilierade och sekretoriska celler, som påminde om in vivo-epitelstrukturen . Förmågan att producera epitellinjer med lämpliga celltyper från en stamcellspopulation kan vara ett användbart verktyg för att studera fysiologisk epitelutveckling och homeostas och utveckla akuta och kroniska sjukdomsmodeller in vitro.
cancercellsodling
sedan den första cancercellslinjen, HeLa-cellinjen, etablerades från en livmoderhalscancerpatient 1951, har cancercellslinjer etablerade från en mängd olika cancertyper använts i stor utsträckning för att studera cancerpatobiologin och gav möjligheter att generera in vivo xenograftmodeller och testa anti-cancerläkemedel in vitro och in vivo. Även om enorma framsteg har gjorts i cancerbiologi med hjälp av cancercellinjer, kan resultaten som erhållits med hjälp av dessa celler inte tillräckligt återspegla sjukdomens komplexitet som ursprungligen förväntades eftersom cancer uppvisar interpatient och intratumor heterogenitet, vilket avslöjades av de senaste framstegen inom nästa generations sekvensering . För att mer exakt återspegla cancerfenotyper, inklusive patientens genmutationsstatus och patologi, utvecklade Welm och kollegor Patient-derived xenograft (PDX) modeller av bröstcancer i nonobese diabetic severe combined immunodeficiency (NOD-SCID) möss som behöll de väsentliga egenskaperna hos de ursprungliga tumörerna och uppvisade metastatisk kapacitet till specifika platser . Förutom bröstcancermodellen visade etableringen av olika typer av fasta tumörer genomförbarheten av PDX-modeller, som förväntas påskynda den prekliniska testningen av nya cancerterapier och hjälpa till att förverkliga målet om ”personlig medicin”.
odlingsmetoder för vuxna stamceller, såsom organoid-och matarsystem, är också tillämpliga på olika tillvägagångssätt som använder patientbaserade cancerceller. Specifikt rapporterade Clevers och kollegor att organoidkultur kan användas för att modellera bukspottkörtel , prostata och kolorektal cancer och visade att de ursprungliga canceregenskaperna , inklusive genetisk heterogenitet och läkemedelskänslighet, kan rekapituleras. Därför kallade de detta system en ”levande organoid biobank”. Dessa tekniker kan också användas för att isolera en stamcellspopulation från en precancerös lesion, såsom Barretts matstrupe, en föregångare till humant esophageal adenokarcinom . Isolerade och expanderade Barretts esofagusstamceller transformerades genom att införa SV40 stort t-antigen, hTERT och c-myc och xenografted i immunkomprometterade NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) möss . Som förväntat transformerades Barretts esofagusstamceller till esophageal adenokarcinomliknande tumörer hos möss. Ett liknande tillvägagångssätt visade att humana oviduktala stamceller var ursprungscellen i höggradig serös äggstocksepitelcancer . Detta resultat bekräftar nyligen mänsklig patologi och de transgena musmodellbevisen, vilket indikerade att det distala oviduktala epitelet är ursprungsvävnaden för denna cancer . I kombination med CRISPR/Cas9-systemet transformerades normala kolonstamceller sekventiellt genom att införa drivmutationerna som ofta detekteras i kolorektal cancer . De resulterande cellerna fick bilda xenografter i njurkapseln och uppvisade progressiv omvandling till adenokarcinomliknande fenotyper kännetecknade av invasiva och metastatiska egenskaper. Sammantaget underlättar förmågan att isolera och odla celler från tumör – och patientmatchade normala epitelvävnader produktionen av en plattform som inte bara kompletterar klassiskt in vivo-djurarbete inom cancerbiologi utan också underlättar patientspecifik genetik och genomik tillvägagångssätt in vitro.
modellering av inflammationssjukdom med vuxna stamceller
modellering av mänsklig sjukdom hindras av den begränsade tillgängligheten av mänskliga sjuka vävnader. Ändå har framsteg inom vuxen stamcellodling gjort det möjligt för oss att reproducera sjukdomsfenotyper in vitro genom att expandera stamceller och härleda mogna celltyper från små humana biopsiprover. Eftersom 3D-odlingsmetoder, såsom ALI och organoidkultur, ger strukturer som består av flera celltyper och liknar epitelarkitekturen observerad in vivo, bör de vara lämpliga för att studera inflammatoriska sjukdomar, inklusive smittsamma och ärftliga sjukdomar. Specifikt är reproduktion av sjukdomsfenotypen enkel när patogenen (eller huvudorsaken) och riktad celltyp är kända.
pseudomembranös kolit (PMC) orsakas av en oproportionerligt ökad population av Clostridium difficile (C. difficile) efter antibiotikabehandling. C. difficile är en grampositiv, sporbildande bakterie och producerar toxinerna med hög molekylvikt TcdA och TcdB, som inducerar vätskesekretion, inflammation och kolonvävnadsskada. Kolon epitelceller differentierade från klonogena kolonstamceller i ALI-kulturen utmanades med dessa toxiner, vilket orsakade förödande epitelskador på ett tids – och dosberoende sätt. Detta resultat indikerade att 3D-kulturmodellen kan användas för att representera C. difficile patologi . På liknande sätt studerades effekten av Helicobacter pylori (H. pylori) – infektion, som orsakar kronisk gastrit, magsår och cancer, genom mikroinjektion av H. pylori i organoidkulturer. Bakterieinfekterade organoidkulturer uppvisade ökad inflammation, såsom NF-kB-aktivering och IL8-induktion, och IL8-uttrycket var signifikant högre i organoidkulturer av körteltyp än i organoidkulturer av pit-typ .
vuxna stamceller har också använts för att modellera ärftlig sjukdom. Beekman och kollegor rapporterade en tarmorganoidkultur härrörande från patienter med cystisk fibros (CF). CF orsakas av mutationer i cystisk fibros transmembran konduktansregulator (CFTR), som normalt uttrycks i epitelcellerna i många organ, såsom lung-och matsmältningsvävnader. Även om normala intestinala organoidkulturer uppvisade robust svullnad som svar på Forskolin, observerades inte svullnadssvaret i CF-organoidkulturer . Dessutom, när den muterade CFTR-platsen korrigerades med CRISPR / Cas9-tekniken i tarmorganoider hos CF-patienter, visade sig de korrigerade generna fungera funktionellt . Därför ger in vitro-differentiering av vuxna stamceller, som liknar in vivo-fenotyper med flera celltyper i kombination med genredigeringsteknik, kraftfulla medel för behandling av mänsklig sjukdom och kan ge direkt inblick i mänsklig patologi.
tillämpning av epitelstamceller för regenerativ medicin
trots lovande strategier som använder mänskliga embryonala stamceller och inducerade pluripotenta stamceller (iPS) för tillämpningar inom regenerativ medicin, några kliniska prövningar av dessa strategier pågår, vilket delvis beror på svårigheter i härstamningsspecifikation och möjligheten till tumörgenes. Eftersom vuxna stamceller i huvudsak är engagerade i specifika vävnadstyper är det relativt enkelt att producera avsedda celltyper och den potentiella risken för tumörgenes är låg. Således syftar terapeutiska tillvägagångssätt till att använda vuxna stamceller som cellkälla för transplantation. Även om Green och kollegor etablerade den mänskliga keratinocytodlingsmetoden 1975 och de odlade cellerna transplanterades till patienter med brännskador eller kemiska skador, var den långsiktiga odlingen av andra typer av vuxna stamceller föremål för betydande tekniska hinder. Som beskrivits ovan övervann de senaste tekniska framstegen denna begränsning för olika typer av epitelceller. Därför är förmågan att snabbt och effektivt expandera stamcellspopulationer värdefull för deras användning i regenerativ medicin.
till exempel har mus lgr5+ kolonstamceller expanderats i organoidkultur och transplanterats i den skadade muskolonen, och engraftade celler som kunde självförnyas och differentieras upptäcktes även efter 25 veckor . I ett annat tillvägagångssätt utnyttjade Zhang K och kollegor konstruerade vuxna stamceller för en transplantationsstudie. Först odlade de framgångsrikt hornhinnepitelceller i en skål utan matarceller och fann sedan att Pax6 är en nyckeltranskriptionsfaktor som skiljer hornhinnestamceller (CSC) från hudkeratinocyter. Överraskande inducerade Pax6-överuttryck i keratinocyter limbala stamcellsliknande celler, och dessa celler kunde transplanteras i de skadade hornhinnorna hos kaniner . Eftersom keratinocyter är mer lättillgängliga än CSC, kan denna metod vara tillämplig för behandling av mänsklig ögonsjukdom. På senare tid, Liu et al. rapporterade ett attraktivt tillvägagångssätt för vävnadsreparation och regenerering som använde endogena stamceller. I sin studie karakteriserades linsepitelstamceller (LECs) som uttryckte Pax6 och Bmi1 och uppvisade regenerativ potential in vivo. En kirurgisk kataraktborttagningsmetod som bevarar endogena Lec användes, och dessa LEC bidrog till spontan regenerering av linser med visuell funktion hos kaniner, makaker och mänskliga spädbarn. Denna metod kan vara ett terapeutiskt genombrott för kataraktbehandling och potentiellt ersätta artificiell intraokulär linsimplantation .
på grund av de höga omsättningshastigheterna för många epitelceller är transplantation av stamcellspopulationer avgörande för långvarigt vävnadsunderhåll. Teoretiskt kan en enda stamcell rekonstituera hela vävnader, och flera forskargrupper demonstrerade empiriskt denna uppfattning . Trots potentialen hos pluripotenta stamceller (PSC), som kan ge upphov till alla celltyper, kan PSC-härledda vävnadsstamceller sannolikt inte bibehållas i omogna tillstånd in vitro. Därför ger användningen av vuxna stamceller för regenerativ medicin en betydande fördel.