förhållandet mellan tidsperiod efter vasektomi och reproduktionskapaciteten hos spermier som erhållits genom epididymal aspiration

Abstrakt

bakgrund: det är inte väl definierat om den förflutna tiden efter vasektomi har något inflytande på resultatet av IVF–ICSI med epididymal Sperma. Vi analyserade retroaktivt resultaten av 151 ICSI-cykler där spermier av vasektomiserade män användes vid olika tidsperioder efter vasektomi. Metoder: oocyter erhölls efter ett desensibiliserande ovariestimuleringsprotokoll med användning av GnRH-agonist i samband med rekombinant FSH och HCG. Spermier hämtades genom perkutan epididymala spermier aspiration. Cyklerna delades upp i tre grupper: 10 år efter vasektomi (Grupp 1, n = 47), 11-19 år efter vasektomi (Grupp 2, n = 79) och 20 år efter vasektomi (grupp 3, n = 25). RESULTAT: Som förväntat skilde sig medelåldern för män i de tre grupperna (grupp 3 > Grupp 2 > Grupp 1) och medelåldern för kvinnorna var också signifikant högre i Grupp 3 än i Grupp 1 och 2, även om inga skillnader beskrevs mellan Grupp 2 och 3. Alla andra laboratorie-och kliniska parametrar var likartade i de tre grupperna. Pågående graviditet och implantation (34, 25, 8% respektive 22, 15, 6%) minskade signifikant från grupp 1 till grupp 3. SLUTSATS: Graviditet och implantationshastigheter efter ICSI med spermier från vasektomiserade män är negativt korrelerade med tidsintervallet från vasektomi, vilket inte kan förklaras enbart av manlig eller kvinnlig åldrande.

Inledning

ICSI är en framgångsrik assisterad reproduktion behandlingsteknik som utvecklades ursprungligen för att lindra manlig faktor infertilitet (Palermo et al., 1992; Van Steirteghem et al., 1993). Resultaten som uppnåtts med ejakulerad Sperma verkar inte vara relaterade till spermiekoncentration eller morfologi (Nagy et al., 1995a; Svalander et al., 1996). Prognosen äventyras endast i de fall där inga rörliga spermier finns (Nagy et al., 1995a).

Epididymal och testikelsperma aspiration används rutinmässigt för att erhålla spermatozoa i fall av obstruktiv och icke-obstruktiv azoospermi. Befruktningsgraden liknar i dessa fall de som erhålls med spermier från ejakulatet (Nagy et al., 1995b; Van Steirteghem et al., 1998). ICSI har därför blivit ett effektivt alternativ för att återställa fertiliteten i fall efter vasektomi där en reanastomos har misslyckats eller tidsintervallet från vasektomi har resulterat i sekundära ställen för epididym obstruktion. Dessutom kan ICSI eliminera de negativa effekterna på fertiliteten hos anti-spermier antikroppar som ofta förekommer hos dessa män (Heidenreich et al., 1994). I de flesta obstruktiva fall, inklusive post-vasektomiserade män, är epididymal spermaaspiration den metod som valts för att erhålla spermier (Craft et al., 1995). Fin nål aspiration, som en teknik, är ett enklare och mindre invasivt förfarande än mikrokirurgisk ingrepp på epididymiderna eller på testiklarna (Tournaye et al., 1998).

nya rapporter tyder på att manlig fertilitet minskar med åldern (Auroux, 1993). Det har emellertid tidigare publicerats att hos normala friska män minskar spermakvaliteten i sig inte signifikant med tiden (Fisch et al., 1996). Dessutom verkar ICSI-resultatet inte vara relaterat till faderns ålder (Spandorfer et al., 1998).

å andra sidan har tidsrelaterade negativa effekter på spermakvalitet och fertilitet beskrivits hos post-vasektomiserade män (Urry et al., 1990). En högre förekomst av anti-spermier antikroppar och spermier klumpning tillsammans med en minskning av andelen rörliga spermier har rapporterats (Weiske, 2001).

på grund av ovanstående fördelar med ICSI jämfört med reanastomos är en betydande del av obstruktiva azoospermiska patienter som söker behandling av ICSI vasektomiserade män. Eftersom det för närvarande inte är känt om perioden efter vasektomi har någon inverkan på resultatet av ICSI-IVF, analyserade vi förhållandet mellan tidsperioden efter vasektomi och spermiernas reproduktionskapacitet efter ICSI.

material och metoder

vi analyserade retroaktivt resultaten av 151 ICSI-cykler, utförda på grund av obstruktiv azoospermi efter vasektomi, slutförd under perioden juni 1998 till juni 2000. Patienterna tilldelades tre grupper enligt tidsperioden efter vasektomi. Intervallet från vasektomi avrundades till närmaste avslutade år från datumet för vasektomi till tiden för ICSI. Alla fall hänvisades till vårt centrum eftersom de valde ICSI framför reanastomos av vas som den primära formen av terapi. Alla fall genomgick perkutan epididymal spermaaspiration (PESA) som teknik för att erhålla spermier. Grupp 1 bestod av 47 cykler där tidsperioden från vasektomi var 10 år; Grupp 2 involverade 79 cykler där tidsperioden från vasektomi var mellan 11 och 19 år och Grupp 3 inkluderade 25 cykler där tidsperioden från vasektomi 20 år.

äggstocksstimulering utfördes med användning av en kombination av en GnRH-agonist (leuprolidacetat, Lupron, 2, Abbott laborat, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, S, Brasilien). Follikulär utveckling övervakades med periodiska mätningar av serumöstradiol och vaginal ultraljud. HCG 10 000 IE (Profasi; Serono Laboratorios) administrerades när minst två folliklar nådde en medeldiameter på 18 mm och oocythämtning utfördes genom ultraljudsstyrd transvaginal aspiration 34 timmar senare.

Epididymal spermier aspiration

spermier hämtades av PESA. En 27,5 gauge nål infördes i den proximala delen av epididymis (vanligtvis belägen i testikelns övre pol) och en delikat sugning utfördes med en 1 ml spruta (B-D; Becton Dickinson Ind. Curitiba, Brasilien). Aspiratet placerades i en petriskål och spolades med IVF-50 medium (IVF Science Scandinavian, Göteborg, Sverige). Provet bedömdes med avseende på närvaron av rörliga spermier. Om det inte fanns några rörliga spermier i provet, upprepades den epididymala aspirationen.

embryologilaboratorieprocedurer

oocyter uppsamlade i ren follikelvätska skickades omedelbart till det intilliggande embryologilaboratoriet, där de identifierades med hjälp av ett dissekeringsmikroskop vid förstoring av 50-talet. Efter att ha identifierats placerades oocyter i en enda brunnskulturskål (3260; Costar, Cambridge, MA, USA) med 1,0 ml 80 IE/ml hyaluronidas (Hyase-1; IVF Science Scandinavian) i 30 s och tvättades därefter flera gånger i IVF-50-medium. Varje oocyt placerades separat inuti en droppe av 30 occyl IVF-50 medium och täckt med lättviktig mineralolja (Ovoil 150; IVF Science Scandinavian) och inkuberades i 2-4 h vid 37 occyl C i en atmosfär med 5% CO2. Vid slutet av inkubationsperioden avlägsnades cumulus-och corona radiata-celler med en plastpipett med en diameter på 135 kg, ansluten till en cellstrippare (Mid Atlantic Diagnostics Inc., Medford, NJ, USA).

Kärnmognad och ooplasmisk kvalitet utvärderades med hjälp av ett inverterat ljusmikroskop (Nikon Diaphot Microscope Macau; Nikon Corporation, Tokyo, Japan) vid förstoring av 200 eller 400 0. Metafas-II (MII) oocyter mikroinjekterades inom en period av 2-4 timmar efter insamling. Metafas I (MI) oocyter observerades för extrudering av den första polära kroppen med 4 h intervall upp till 8 h efter hämtning och injektionen utfördes i enlighet därmed. Metoderna för spermieinjektion har tidigare rapporterats (Abdelmassih et al., 1996).

efter spermieinjektion inkuberades oocyter i 1 ml IVF-50-medium, täckt med mineralolja, för 16-18 h. oocyter observerades 16-18 h efter ICSI för närvaro eller frånvaro av pronuclei och polära kroppar (Nagy et al., 1998a). Befruktning ansågs normalt när två tydligt distinkta pronuclei var närvarande. Om en enda pronukleus observerades utfördes en andra utvärdering ungefär 4 timmar senare. När närvaron av tre pronuklei detekterades kasserades oocyten.

oocyter innehållande två pronuclei odlades separat i droppar av 30 occyl IVF – 50 medium täckt med mineralolja i en petriskål (3260; Costar) och hölls tills överföring. Embryona observerades vid 42 timmar (dag 2) och vid 68 timmar (dag 3) efter injektion och klassificerades enligt de kriterier som föreslagits av Staessen (Staessen et al., 1989). Enligt antalet blastomerer och den relativa andelen anukleatfragment närvarande i zona pellucida klassificerades embryon till en av de fyra kategorierna: 1, utmärkt (Typ A), när inget anukleatfragment var närvarande (6-till 8-cellsteg på dag 3); 2, bra (Typ B), när <20% av embryot fragmenterades (6 – till 8-cellsteg på dag 3 eller <6 celler utan fragmentering); 3, rättvis (Typ C), när den relativa mängden fragment var mellan 20 och 50%; och 4, Dålig (Typ D), när >50% av embryot fragmenterades. Embryon med >50% fragmentering överfördes inte.

vid tidpunkten för överföringen laddades embryon i 15 occyl IVF-50-medium med en Edwards Wallace-kateter på 23 cm (Simcare Manufacturing Ltd, Hythe, Kent, UK).

Den luteal fas stöddes av daglig administrering av 800 mg vaginal progesteron (Utrogestan®; Laboratoires Besins-Isvovesco, Paris, Frankrike) och transdermic 100 µg östradiol plåster byts dagligen (Estraderm TTS100®; Biogalênica Laboratório, São Paulo, Brasilien). Serum-hCG-nivåerna mättes 12 dagar efter embryoöverföringen.

Transvaginal ultraljud utfördes hos alla patienter med stigande hCG-hCG-titrar; närvaro och antal intrauterina graviditetssäckar bedömdes, liksom närvaron av en fosterpol och hjärtaktivitet. Graviditeten övervakades av patientens förlossningsläkare och det slutliga resultatet rapporterades till kliniken både av förlossningsläkaren och patienten.

statistisk analys

envägsanalys av varians (ANOVA) och Kruskal–Wallis tester användes för att jämföra medel för kvinnlig och manlig ålder, befruktningshastighet, embryokvalitet, antal överförda embryon och tidsperiod efter vasektomi. Beredskapstabellanalys och Fishers exakta tester användes för att jämföra graviditet, implantation och abort.

resultat

de viktigaste resultaten av de 151 cykler som ingår i studien presenteras i tabell I. Medelåldern för män ökade från grupp 1 till 3, och skillnaden mellan varje grupp var statistiskt signifikant (P < 0,0001). Genomsnittlig kvinnlig ålder var signifikant lägre i Grupp 1 jämfört med Grupp 2 och 3 men inte annorlunda i Grupp 2 jämfört med grupp 3 (Tabell i).

det genomsnittliga antalet oocyter som hämtats och injicerats och befruktningshastigheterna var lika i alla tre grupperna. Kvaliteten på embryona och antalet överförda embryon var också lika i de tre grupperna (tabell i).

den kliniska graviditetsgraden och den pågående graviditetsgraden korrelerade signifikant med tidsperioden för vasektomi (P < 0, 05; 2CG-test för trend), och den längre perioden av vasektomi var associerad med färre graviditeter (tabell i). Implantationshastigheten minskade också från grupp 1 till 3, och skillnaden mellan alla grupper var statistiskt signifikant (P < 0,05, beredskapstabellanalyser och Fishers exakta test). Abortfrekvensen visade en tendens att öka från grupp 1 till 3 men den nådde inte statistisk signifikans bland grupperna.

för att utesluta effekten av kvinnlig ålder på resultaten analyserade vi data från 84 av de 151 cyklerna där endast de kvinnor som var 35 år gamla var inkluderade. Resultaten, organiserade på samma sätt i tre grupper, presenteras i tabell II. skillnaden i den genomsnittliga manliga åldern för de tre grupperna förblev signifikant (P < 0,0001) men kvinnlig ålder skilde sig inte signifikant mellan de tre grupperna. Antalet injicerade och befruktade oocyter var också lika i de tre grupperna samt antalet och kvaliteten på embryon som överfördes till patienterna. Pågående graviditet och implantation var signifikant högre i Grupp 1 och 2 jämfört med grupp 3 (Tabell II).

diskussion

våra data bekräftar att perkutan epididymal spermaaspiration i kombination med ICSI är ett framgångsrikt behandlingsalternativ för lindring av post-vasektomi infertilitet. Tekniken för spermhämtning är enkel, utförs med lokalbedövning och kan upprepas utan uppenbar skada på epididymis.

viktigt är att resultaten av vår studie föreslår för första gången en negativ korrelation mellan graviditetsresultatet av assisterad befruktning och tidsintervallet från vasektomi till behandling. Skillnaden i graviditet och implantation kvarstod efter att resultaten korrigerades för kvinnornas ålder. De enda uppenbara kliniska skillnaderna kvar var medelåldern för män mellan grupperna och tidsperioden för vasektomi. Påverkan av manlig ålder på resultaten av assisterad reproduktion är inte väl bestämd. Vissa studier tyder på en minskning av fertilitetspotentialen med stigande manlig ålder (Auroux, 1993), men de flesta studier fastställde inte en korrelation mellan åldrandet och reproduktionspotentialen hos män (Krause och Habermann, 2000). Även individuell uppföljning i upp till 25 år avslöjade inga viktiga förändringar (Fisch et al., 1996). Ännu viktigare när det gäller vår studie påverkas ICSI-resultat för olika diagnostiska kategorier inte av den manliga partnerns ålder (Spandorfer et al., 1998) i motsats till den viktiga rollen som den kvinnliga partnerens ålder (Abdelmassih et al., 1996; Devroey et al., 1996).

framgångsgraden för vasektomiåterföring vid återställande av fertilitet är ett omvänt förhållande till tidsintervallet från vasektomi (Belker et al., 1991). Hittills har de tidsrelaterade negativa effekterna av vasektomi i förhållande till fertilitet tilldelats mekaniska faktorer (den ökande förekomsten av sekundära ställen för epididymalobstruktion) som gjorde anatomisk restaurering svårare och till uppkomsten av signifikanta titrar av anti-spermier antikroppar (Heidenreich et al., 1996). ICSI övervinner uppenbarligen den mekaniska blockeringen och resultaten som erhållits med tekniken är oberoende av immunologiska faktorer (Nagy et al., 1995c).

alla fall som ingår i vår studie genomgick epididymala spermier aspiration. Silber et al. har föreslagit att i fall av kroniskt obstruerad epididymis drabbas spermier av förändringar relaterade till åldrande med en signifikant minskning av rörligheten mot den distala delen (Silber et al., 1995). Å andra sidan har Moore rapporterat att i dessa fall finns ett oproportionerligt antal döda eller döende spermier också i den proximala delen (Moore, 1998). Författaren föreslår att under normala förhållanden skyddar epididymvätska livskraftig sperma från akrosomala enzymer som frigörs av spermier i degenerationsprocessen. Stagnationen sekundär till kronisk obstruktion skulle störa denna skyddsmekanism. Dessutom har det visats att hos män med obstruktiv azoospermi är testikulärt sperm-DNA signifikant mindre skadat än proximal epididymal sperm-DNA (Steele et al., 1999). I samma studie fann författarna att DNA-kvaliteten i spermier som erhållits från testikeln är densamma som den som finns hos normala män, vilket tyder på att skadan som finns i epididymala spermier förvärvas med tiden efter att ha producerats. Det är frestande att spekulera i att epididymala spermier DNA-skador ökar med tiden för obstruktion och, i de fall som presenteras här, tid från vasektomi. I samma tankegång var användningen av immotil (på grund av nekrozoospermi) ejakulerad eller epididymal sperma för ICSI associerad med mycket dålig befruktning och embryonal utveckling; testikelsperma (från samma patient), även om det är immotilt, gav emellertid ett mycket förbättrat resultat av behandlingscykeln (Nagy et al., 1995a; Tournaye et al., 1996; Nagy et al., 1998b).

i denna studie observerades inga signifikanta skillnader i befruktningshastigheten och i kvaliteten på embryon som överfördes vid 72 timmar efter befruktning bland de tre grupperna. Effekterna av att använda molekylärt skadad sperma på befruktning kan maskeras med användning av ICSI, och tidiga stadier av embryonutveckling beror huvudsakligen på moderinformation eftersom det embryonala genomet aktiveras efter 8-cellsteget (Braude et al., 1988). Ökad DNA-skada av epididymala spermier (används uteslutande i de rapporterade fallen) kan emellertid utgöra en förklaring till de lägre embryoimplantationshastigheterna och för högre abortfrekvenser som finns i fallen med en längre period från vasektomi.

våra resultat skiljer sig från de data som rapporterats av andra (Sukcharoen et al., 2000) men kan inte vara i direkt motsägelse. Antalet fall som ingår i vår studie var signifikant större och de tidigare rapporterade uppgifterna inkluderade några fall där ICSI utfördes med spermier erhållna från testiklarna.

de resultat som rapporteras här kan ha viktiga kliniska konsekvenser. Perkutan epididymal spermaaspiration är ett enkelt, snabbt och populärt förfarande för att få spermier från män med obstruktiv azoospermi; i ljuset av den aktuella studien kan emellertid fin nål aspiration från testiklarna representera ett bättre tillvägagångssätt, särskilt i de fall med långvarig tid för obstruktion. Ytterligare insamling och analyser av data som erhållits från prospektiva studier bör dock utföras för att fastställa det bästa ingreppet i dessa fall.