afinita hemoglobinu k kyslíku u tří poddruhů ropuchy (Bufo sp.), žijících v různých nadmořských výškách
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 Clinicum Laboratorio Automatizado, Iquique, Chile
2 Laboratorio de Transporte de Oxígeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile
ABSTRAKT
afinitu kyslíku v Krvi a červených krvinek vlastnosti byly měřeny ve třech poddruhů rodu Bufo: Bufo spinulosus limensis, shromažďovány na úrovni hladiny moře a při průměrné denní teplotě 20 ° C; Bufo spinulosus trifolium, 3100 m, průměrná denní teplota 15ºC; a Bufo spinulosus flavolineatus, od 4100 m, průměrná denní teplota 10ºC. Elektroforéza hemoglobinu vykazovala stejnou složku v každém ze tří poddruhů. Při 20ºC afinity krevního kyslíku (P50) vykazovaly malé rozdíly mezi Bufo spinulosus limensis a Bufo spinulosus trifolium, zatímco hodnota pro Bufo spinulosus flavolineatus byla výrazně nižší. Při 10 ° C, okolní teplotě Bufo spinulosus flavolineatus, byl P50 extrémně nízký ve srovnání s ostatními dvěma poddruhy při odpovídajících okolních teplotách.
KLÍČOVÁ SLOVA: adaptace, nadmořská výška, obojživelníci, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, hemoglobin afinita, hematocrits, vázající kyslík, ropuchy
ÚVOD
V Peru rodu Bufo zaujímá výškový gradient od hladiny moře do výše 4000 m. Druh Bufo spinulosus má tři poddruhy, jejichž výklenky jsou v nízkých, středních a vysokých nadmořských výškách. Tyto poddruhy jsou Bufo spinulosus limensis (nízké nadmořské výšce), Bufo spinulosus trifolium (střední nadmořská výška) a Bufo spinulosus flavolineatus (vysoká nadmořská výška) (12). Jednou z nejintenzivněji studovaných environmentálních adaptací dýchacího systému u obratlovců je hypoxie, která se vyskytuje různě ve vysoké nadmořské výšce, v embryonálním vývoji (např. Tyto úpravy obvykle zahrnují změny ve vlastnostech červených krvinek, v kapacitě nesoucí kyslík nebo v kyslíkové afinitě hemoglobinu. Vnitrodruhových úpravy, které se vyskytují ve stejné zvířat za různých podmínek, obecně zahrnují změny v alosterický faktory (tj. podmínky, za kterých hemoglobinu funkce uvnitř červených krvinek), vzhledem k tomu, že mezidruhové úpravy, které jsou patrné při srovnání různých druhů, lze připsat na vrub změnám ve vlastnostech molekuly hemoglobinu.
Většina studií na hypoxické adaptace v červených krvinek a hemoglobinu vlastnosti se vztahují na ryby a savci, a jen velmi málo je známo o nižší ektotermní obratlovce. Dřívější studie ukázala, že Jezero Titicaca žába Telmatobius culeus (2), žijící v 3800 m. měli vyšší krevní O2 afinitou a menší krevní buňky, než hladina moře žáby. Tato studie popisuje adaptace v poddruhu Bufo.
MATERIÁL A METODY
Žáby poddruh Bufo spinulosus limensis byly shromážděny z pobřežní pláně na přibližně 400 km od naší laboratoři v Limě (mořem, průměrná denní teplota 20ºC). Bufo spinulosus trifolium byly shromážděny v Centrálních Peruánských Andách (asi 3100 m, průměrná denní teplota 15ºC), a Bufo spinulosus flavolineatus také v Centrálních Andách (na 4100 m, průměrná denní teplota 10 ° C). Zvířata byla přivezena do naší laboratoře během několika hodin. Krev byla odebrána v heparinizovaných injekčních stříkačkách ze srdcí dříve zubatých zvířat. Přibližně 3 ml krve lze získat z Bufo spinulosus limensis a 1 až 1, 5 ml z ostatních poddruhů. Krev ze dvou až tří zvířat byla shromážděna za účelem provedení stanovení. Počty červených krvinek, koncentrace hemoglobinu a hematokrity byly měřeny konvenčními technikami.
Elektroforéza hemoglobinu byl běh na acetát celulózy proužky do vyrovnávací paměti specifické pro elektroforéza hemoglobinu, a kapely byly obarvené Ponceau S a číst v densitometrické podle Helena Laboratories (USA), návod k použití.
afinita krve a kyslíku (P50) byla měřena technikou míchání (1,10) při 10ºC, 15ºC a 20ºC. Krev ustavení rovnováhy byla provedena v tonometru udržována na tyto teploty pomocí plynové směsi obsahující 4.5% CO2 a variabilní O2 a N2 koncentrace. Saturace krve O2 se pohybovala mezi 30 a 80%. Měřič pH byl kalibrován pomocí vysoce přesných fosfátových pufrů.
hodnoty pH na rovnovážné teploty (eq) byly vypočteny z těch, na měření teploty (mea) pomocí rovnice dána Rosenthal (8):
phrovn = pH meas + 0.0147 (Teq _ Tmeas)
Bohr faktor byl získán změnou pH krve takto. Plazma připravená z krevních alikvotů byla buď okyselena kyselinou mléčnou nebo alkalizována hydroxidem sodným a rekonstituována odpovídajícími červenými krvinkami. Vzorky krve od Bufo spinulosus limensis a Bufo spinulosus trifolium byly rovnovážného stavu při 20 ° c a 15ºC a krev z Bufo spinulosus flavolineatus při 20 ° c a 10 ° C a při různých hodnotách pH, aby se vypočítal Bohr faktor pro každou teplotu (14). Tento faktor umožnil výpočet standardního pH krve při třech teplotách. Pro výpočet Kopcového koeficientu (n) byla použita metoda postupných aproximací (10). Hodnota z bohrovy rovnice pro každý poddruh byla vypočtena z dat v samostatných experimentech.
van ‚t Hoffova rovnice byla použita pro výpočet celkového tepla oxygenace DH‘ z hodnot P50. Pro Bufo spinulosus limensis byly použity hodnoty při 20ºC a 15ºC při teplotě okolí 20ºC. Pro Bufo spinulosus trifolium byly použity hodnoty při 15ºC a 20ºC při teplotě okolí 15ºC. Pro Bufo spinulosus flavolineatus byly použity hodnoty při 10ºC a 20ºC při teplotě okolí 10ºC. Statistická významnost byla stanovena studentským t testem se softwarem Systat 6.0 pro Windows.
výsledky
tabulky I a II shrnují hematologické údaje. Není žádný statistický rozdíl mezi hodnotami Bufo spinulosus limensis a Bufo spinulosus trifolium. Hodnoty hematokritu, hemoglobinu a množství RBC v Bufo spinulosus flavolineatus jsou mnohem nižší.
elektroforézy experimenty ukázaly stejné migrační vzdálenosti při hemoglobins každého ze tří poddruhů a přítomnost dvou kapel v některých tratí (Obr. 4). Nebyly provedeny žádné další studie k definování vlastností hemoglobinu.
Tabulka II ukazuje funkční vlastnosti hemoglobinu v krvi, odhalující malé rozdíly v P50 mezi Bufo spinulosus limensis a Bufo spinulosus trifolium, vzhledem k tomu, že hodnota pro Bufo spinulosus flavolineatus je nižší. Hodnoty při okolní teplotě, kde byla zvířata odebrána, se mezi Bufo spinulosus limensis a Bufo spinulosus trifolium významně nelišily. V případě Bufo spinulosus flavolineatus je hodnota P50 při 10 ° C velmi nízká. Obrázek 1 znázorňuje závislost log P50 vs. pH. Obrázek 2 ukazuje hemoglobinu kyslíkem disociační křivky konstruovány s hodnotami P50 a Kopec je koeficient při 20 ° C. křivky pro Bufo spinulosus limensis a Bufo spinulosus trifolium jsou velmi blízko u sebe, vzhledem k tomu, že pro Bufo spinulosus flavolineatus je posunuta doleva. Obrázek 3 je graf obsahu O2 v krvi vs. krevní PO2 při okolní teplotě každého poddruhu. To ukazuje na nízký obsah O2, a velmi nízké P50 Bufo spinulosus flavolineatus a mírný posun doleva Bufo spinulosus trifolium ve srovnání s Bufo spinulosus limensis bez snížení obsahu O2 v krvi Bufo spinulosus limensis a Bufo spinulosus trifolium.
obr. 1: Bohrův efekt u tří poddruhů Bufo spinulosus. Bufo spinulosus flavolineatus vykazuje největší Bohr faktor.
obr. 2: křivka krevní disociace pro tři poddruhy při pH 7,84 a 20 ° C. Křivka Bufo spinulosus flavolineatus je posunuta doleva.
obr. 3: obsah hemoglobinu O2 vs parciální tlak kyslíku pro každý poddruh při příslušné ekologické teplotě. Bufo Spinulosus limensis (20 ° C), Bufo spinulosus trifolium (15 ° C)Bufo spinulosus flavolineatus (10º C). Obsah hemoglobinu Bufo spinulosus flavolineatus je nižší než u dvou dalších poddruhů a P50 je velmi nízký.
obr. 4: elektroforéza tří poddruhů Bufo Spinulosus. Experiment ukazuje stejné migrační vzdálenosti v hemoglobinech každého ze tří poddruhů a přítomnost dvou pásem v některých bězích.
Tyto výsledky ukazují, že při 20 ° c Bufo spinulosus flavolineatus, jejichž přirozené prostředí je v blízkosti 4000 m a jehož okolní teplota průměry 10ºC, má nízký obsah hemoglobinu a vysokou afinitu hemoglobinu když ve srovnání s Bufo spinulosus trifolium, jejichž průměrná okolní teplota nadmořská výška je téměř 3000 m a jehož průměrná teplota okolí je 15ºC. Bufo spinulosus limensis (hladina moře) a Bufo spinulosus trifolium měly téměř identické křivky. Pokud křivky byly získány na okolní teplotě, Bufo spinulosus flavolineatus ukázal velmi nízký obsah O2 a vysokou afinitu hemoglobinu ve srovnání s ostatní dva poddruhy. U Bufo spinulosus flavolineatus vysoká DH‘ indikuje vysokou citlivost afinity hemoglobinu na změny okolní teploty a vysoký Bohrův faktor také naznačuje vysokou citlivost afinity hemoglobinu na změny pH krve.
Rod Bufo je rozšířen v andských zemích. Bufo spinulosus má tři poddruhy, jejichž výklenky se nacházejí v dolních Andských svazích, mezilehlých údolích (3000 m) a nejvyšších pláních (nad 4000 m). Poddruh střední nadmořské výšky Bufo spinulosus trifolium a poddruh hladiny moře Bufo spinulosus limensis se neliší ve svých hematologických hodnotách. Vysoká nadmořská výška Bufo spinulosus flavolineatus má mnohem nižší koncentrace hemoglobinu, ale červené krvinky vlastnosti jsou podobné další dva poddruhy. RBC se zdají být menší než u ostatních dvou poddruhů, na rozdíl od Ruizových (9) nálezů, které naznačovaly opak. Je známo, že rod Bufo má vyšší koncentraci hemoglobinu než ostatní obojživelníci. Hutchinson a Szarki (3) to připisují vysoké vaskularizaci a pozemskému zvyku. Bufo spinulosus flavolineatus má však velmi nízkou koncentraci hemoglobinu.
ve třech skupinách ukazuje elektroforetická studie hemoglobinu jedince, jejichž elektroforetický vzorec představuje dva jasně oddělené hemoglobinové pásy. Není žádný rozdíl v hemoglobinu, afinita mezi Bufo spinulosus trifolium a Bufo spinulosus limensis při 20 ° c, vzhledem k tomu, že v Bufo spinulosus flavolineatus je vyšší. Když spřízněnost byla studována při teplotách okolí kde zvířata žijí, Bufo spinulosus trifolium měl kyslíku, disociační křivky, které posunul mírně doleva Bufo spinulosus limensis, a Bufo spinulosus flavolineatus ukázal velmi výrazný posun, což ukazuje na velmi vysokou afinitu hemoglobinu.
Vysoká nadmořská výška nativní savci a ptáci mají tendenci mít vysoký krevní kyslík spřízněnosti a ne ukázat, polycythemia ve vysoké nadmořské výšce (5). Bylo by zajímavé sledovat, zda jsou tyto reakce na okolní hypoxii a chladné podmínky přítomny u ektotermických zvířat. Teoreticky by chladné podmínky měly pomoci zvýšit toleranci k vysoké nadmořské výšce, protože snižují rychlost metabolismu. V případě Bufo spinulosus flavolineatus,jejichž denní teplota pod kameny na 4100 m o 10ºC a o 6 ° C nebo méně v noci v rybnících, kde odpočívají půl ponoří, vysoká afinita znamená selekční tlak směrem k hypoxii i přes možné snížení metabolismu. Packard a Stiverson (7) nenašel vztah mezi nadmořskou výškou a koncentrace hemoglobinu v refrénu žába (Pseudacris triseriata), ale rozsah výšky ve své studii (1500 m a 3000 m) byly malé.
afinita hemoglobinu je genetická značka zřejmě vybraná hypoxickým prostředím u obratlovců. U savců a ptáků je afinita poměrně pevnou vlastností, která nezvyšuje hypoxii a nezmizí v normoxii (6). Na druhé straně u ryb se krevní kyslík při hypoxii výrazně zvyšuje (13).
ze srovnávacího hlediska existují určité podobnosti mezi ektotermy a endotermy. Bylo zjištěno, že existuje určitá korelace mezi afinitou hemoglobinu a nadmořskou výškou u poddruhů myší zabírajících výškový gradient (11). Bylo také prokázáno, že ve stejné druhů savců žijících podél vertikální gradient v Andách, osoby žijící v nejvyšším rozsahu hemoglobins s vyšší afinitou než jedinci žijící v nejnižší rozsah. Tyto rozdíly byly větší v případě Andské lišky, kde dva samostatné druhy zaujímají dva extrémy výškového rozsahu (4).
tato práce posiluje koncept, že polycythemia není vybrána jako adaptivní parametr pro hypoxické prostředí. Naopak, hemoglobin s vysokou afinitou se zdá být silně vybrán u různých zvířat žijících ve vysoké nadmořské výšce.
poděkování
Děkujeme Dr. Roy E. Weberovi za jeho pomoc při objasnění našeho myšlení na toto téma a za přezkoumání rukopisu.
Odpovídající Autor: Hrvoj Ostojić P. – Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chile. Telefon: (56-57) 420599, Fax: (56-57) 427683, e-mail: [email protected]
obdržel: 13. srpna 1999. Přijato v revidované podobě: květen 6, 2000
bibliografie
1. EDWARDS MJ, MARTIN RJ (1966). Míchací technika pro rovnováhu kyslík-hemoglobin a Bohrův efekt. J Appl Physiol 21:1898-1902
2. HUTCHINSON VH, HAINES HB, ENGEBRETSON G (1976) vodní život ve vysoké nadmořské výšce: respirační adaptace v jezeře Titicaca frog, Telmatobius culeus. Respir Physiol 2: 115-119.
3. HUTCHINSON VH, SZARSKI H (1965) počet erytrocytů u některých obojživelníků a plazů. Copeia: 373-375
4. LEON-VELARDE F, DE MUIZON C, PALACIOS JA, CLARK D, MONGE-C C (1996) afinita a struktura hemoglobinu ve vysokohorských a mořských masožravcích z Peru. Comp Biochem Physiol 113A:407-411
5. MCCUTCHEON FH HALL FG (1937) Hemoglobin v Amfibii. J Cell & Comp Physiol 9:191-197
6. MONGE C, LEON-VELARDE F (1991) fyziologická adaptace na vysokou nadmořskou výšku: transport kyslíku u savců a ptáků. Physiol Rev 71: 1135-1172
7. PACKARD G C STIVERSON RK (1976) koncentrace hemoglobinu v krvi v chorus frog (Pseudacris triseriata): vztah k velikosti těla a nadmořské výšce. Am Midl Nat 96: 482-487
8. ROSENTHAL TB (1948)vliv teploty na pH krve a plazmy in vitro. J Biol Chem 173:25-30
9. RUIZ G, ROSENMANN M, VELOSO a. (1989) Altitudinální distribuce a hodnoty krve v ropuchě, Bufo spinulosus Wiegmann. Comp Biochem Physiol 94A: 643-646
10. SCHEID P, MEYER M (1978) technika míchání pro studium rovnováhy mezi kyslíkem a hemoglobinem: kritické hodnocení. J Appl Physiol 45: 818-822
11. SNYDER GK, ČERNÁ, CP, BIRCHARD GF (1982) Vývoj a metabolismus během hypoxie v embrya vysoké nadmořské výšce Anser indicus versus mořem Branta canadensis husy. Physiol Zool 55:113-123
12. VELLARD J (1959) Estudios sobre batracios andinos V: el género Bufo. Mem Hist Nat Javier Prado Nº 8
13. WEBER RE (1992) Molekulární strategie adaptace obratlovců hemoglobinu funkce v: DŘEVO SC, WEBER RE, HARGENS AR, MILLARD RW (eds) Physiol úpravy v obratlovců, New York: Marcel Dekker
14. WINSLOW RM, MORRISSEY JM, BERGER RL, SMITH PD, GIBSON CC (1978) variabilita afinity kyslíku normální krve: automatizovaná metoda měření. J Appl Physiol: Respirat Environ Cvičení Physiol 45 (2): 289-297