Poissonovo rozdělení, pojmenoval francouzský matematik Siméon Denis Poisson, je pravděpodobnost výskytu daného počtu událostí v dané (pevné) časové období, pokud události, které se vyskytují při konstantní rychlosti (známý) a jsou nezávislé na výskytu předchozí události. Je založen na diskrétním rozdělení pravděpodobnosti, kde sada výsledků je diskrétní nebo konečná, jako je Hod mincí nebo hod kostkou.
v kontextu digitálního PCR experimentu jsou diskrétními výsledky přítomnost nebo nepřítomnost cílového genu. Tisíce jednotlivé oddíly vyrobené pro digitální PCR reakce se očekává, že dodržovat Poissonovo rozdělení s ohledem na oddíly jsou monodispersed a obsahují ekvivalentní objem vzorku směsi.
Pokud tyto parametry nejsou splněny, a oddíly, které vykazují polydispersity, objem vzorku smíchejte ve oddíly budou do značné míry lišit, a větší oddíly mohou obsahovat více cílů, než ty menší, což snižuje přesnost digitální PCR reakce.
v této položce vás provedeme matematickým výpočtem Poissonova zákona pro digitální PCR experiment.
Pro digitální PCR experimentu, dobře obsahující rozdělen vzorek zájmu, a cílový gen kvantifikovat, musíme nejprve definovat následující proměnné:
- \(N\): celkový počet analyzovatelný příčky v dobře
- \(p\): počet pozitivních oddíly pro cílový gen,
- \(v\): objem oddílu (v µL), předpokládá, že je konstantní,
- \(d\): faktor ředění použité k ředění vzorku z populace, aby se dobře
(např. \(d=10\) znamená, že vzorek byl zředěn 10krát)
a pak ty další:
-
\(V = N \ v\) : celkem oddíl objem injekčně v no
-
\(C_{0}\) : koncentrace cílových genů (v kopiích/µL)
-
\(C = d \ C_{0}\) : koncentrace cílových genů v populaci (v kopiích/µL)
-
\(\lambda = C_{0} \ v\) : průměrný počet cílových genů za oddíl v no
Rozdělení cílové geny zapouzdřené v oddílech dobře následuje Poissonovo rozdělení pro parametr \(\lambda\) :
Proba ( oddíl shrnuje \(\text{$k$}\) cílové geny ) \ (v= \dfrac{\lambda^k}{k!} e^{- \lambda}\)
říká se oddíl:
-
„Pozitivní oddíl“, pokud to má zapouzdřené alespoň 1 cílový gen (v takovém případě budeme pozorovat fluorescenční oddíl na konci bodu zesílení procesu, takže většina z nejistoty spočívá v tomto „alespoň jeden“ stavu)
-
„Negativní oddíl“ pokud má zapouzdřené 0 cílový gen (v takovém případě budeme sledovat non-fluorescenční oddíl na konci bodu zesílení procesu)
distribuce pozitivní příčky v dobře sleduje binomické rozdělení pravděpodobnosti \(1 – e^{-\lambda}\):
- Pravděpodobnost (no obsahuje \(\text{$p$}\) pozitivní oddíly \(= {\rm C}_{N}^{p} (1 – e^{-\lambda})^p (e^{-\lambda} )^{N-p} \)
- Pravděpodobnost (oddíl je negativní) \( = e^{-\lambda} \)
- Pravděpodobnost (oddíl je pozitivní) \( = 1 – e^{-\lambda} \)
Pokud \(N\) je dostatečně velký:
- Proba (oddíl je pozitivní) \ (v= \dfrac{p}{N} \)
Takže vzorec pro odhad zásoby koncentrace je:
\( C = – \dfrac{d}{v} \ ln{\left(1 – \dfrac{p}{N} \right)} \)
Pokud potřebujete, aby se automaticky vypočítat odhadované koncentrace cílových genů, spolu s jejich intervalu spolehlivosti a relativní nejistotu, on-line nástroj je k dispozici: Poissonův Zákon: Jít Dále. Zkus to!
další informace o křivkách nejistoty a mezích detekce a kvantifikace naleznete v položce: dynamické rozsahy detekce & kvantifikace.