je důležité mít kontrolu nad virového titru v experimentální práce s viry. Pro usnadnění srovnání studií prováděných v různých laboratořích je žádoucí použít harmonizované standardní metody. Pro lidský herpesvirus 6 (HHV-6) , β-herpesvirus, že většina lidí byli vystaveni , 50% tkáňové kultury infekčnosti dávku (TCID50) metoda je často používána pro virového titru hodnocení. Běžně používaným odečtem je oční kontrola cytopatických účinků (CPE), tj. Jednou z překážek tohoto přístupu je, že buňky se mohou zvětšit, i když nejsou infikovány. Je obzvláště obtížné na hranici infekce v titrační sérii‘, protože buňky zvětšené v důsledku infekce mají tendenci se zvětšovat méně se zvýšeným ředěním viru (další soubor 1: obrázek S1). Imunofluorescenční test (IFA) je alternativní odečtový přístup k oční kontrole při hodnocení TCID50 nebo pro výpočet infekčních jednotek, tj. frakce infikovaných buněk . IFA založené číst-out je více zřetelný v diskriminační infikovány z neinfikovaných buněk, ale na barvení je pracné a značný počet buněk je potřeba spočítat, jak získat spolehlivé hodnoty. Sledování jednotlivých buněk znamená riziko pro dezinterpretaci buňky pozitivity, nevýhodou obou oční kontroly a IFA na základě čtení-out. Proto jsme vyvinuli a validované alternativní čtení-out přístup TCID50, kde nárůst virové DNA zatížení se měří v každé titrace dobře TCID50 kultury desky pomocí real-time kvantitativní PCR (Q-PCR). Tento přístup byl porovnán s oční inspekcí a odečty IFA tcid50 a s přístupem infekčních jednotek popsaným výše.
HHV-6A (GS kmen) byla rozšířena v T-buněčné linii HSB-2 v GlutaMAX obsahuje RPMI 1640 médiu (Invitrogen, Velká Británie) doplněném 10% fetálního bovinního séra (HyClone, UT), 100 U/ml penicilinu a 100 µg/ml streptomycinu (Invitrogen). Po zvětšení přibližně 50% živých buněk byl supernatant odebrán a okamžitě zmrazen v alikvotech při -80°C až do analýzy. Jako kontrola byl supernatant viru průchodu 17 (P17) inaktivován UV světlem po dobu 20 minut nebo tepelným zpracováním při 56°C po dobu 1 hodiny. Replikace HHV-6A v buňkách HSB-2 byla sledována po dobu deseti dnů pomocí Q-PCR (Applied Biosystems, Spojené království), jak bylo popsáno výše . Před Q-PCR analýzy DNA extrahované z buněčných suspenzí pomocí 96-well plate bead-based kit podle výrobce je protokol (MagMAX-96 Virové RNA Isolation Kit, Applied Biosystems). K posouzení obsahu DNA HHV-6A ve virových šaržích byla Q-PCR provedena výše popsaným způsobem po extrakci DNA pomocí filtračních kolon (QIAGEN GmbH, Německo).
pro nastavení kultivačních destiček TCID50 byly buněčné suspenze 40 µl 104 buněk HSB-2 na jamku naočkovány do kultivačních destiček s kulatým dnem 96 jamek. Buňky byly naočkovány po dobu 3-4 hodin 160 µl pětinásobného ředění supernatantu HHV-6A, šest replikátů na ředění. Maketové a střední ovládací prvky byly zahrnuty do trojitých jamek na všech deskách. Buňky byly promyty jednou, než byly odebrány vzorky 50-70 µl buněčné suspenze z každé jamky a uloženy při -80°C jako vzorky po infekci (dpi) v nultém dni. Zbývající buněčné suspenze byly inkubovány po dobu sedmi dnů při teplotě 37°C. Při sedmi dpi byla rozmražená deska s nulovým dpi a sedm dpi desek podrobeno extrakci DNA pomocí soupravy na bázi korálků popsané výše. Poté byla virová DNA kvantifikována Q-PCR, jak je popsáno výše.
Pro IFA buňky byly fixovány na sklíčka s 1:1 směsi acetonu a methanolu při teplotě -20°C po dobu 10 minut, zablokoval s 5% kozí sérum a 3% BSA v PBS a obarveny s primární myší monoklonální protilátky specifické pro HHV-6 je glykoprotein gp116/54/64 (Advanced Biotechnologies, MD). Barvení bylo vizualizováno konjugovaným kozím anti-myším IgG (Invitrogen) Alexa 633. K vizualizaci buněčných jader bylo použito barvení 4′,6-diamidino-2-fenylindolem (Vector laboratories, CA). Krycí pásky byly namontovány s montážním médiem (DAKO A / S, Dánsko) a sklíčka byla analyzována pomocí konfokálního mikroskopu (Leica Microsystems, Německo). Podíl infikovaných buněk byl stanoven ručním počítáním. Pokud ≥1/3 buněk obsahovalo virový protein, bylo započítáno ≥25 buněk na jamku a pokud <1/3 buněk obsahovalo virový protein, bylo započítáno ≥100 buněk na jamku. Studny, kde ≥2% pozitivních buněk bylo považováno za infikované. Úroveň zvýšení virové DNA zátěže v každé jamce byla korelována s barvením IFA konstruujícím vzorec v softwaru Excel (Microsoft, WA). Tento vzorec se ptá, zda virové DNA v určitém no v TCID50 deska se posunula určitý počet časů, který je nastaven, a pokud ten samý no byl pozitivní v IFA nebo ne.
Pro srovnání s Q-PCR, všechny TCID50 desky byly hodnoceny oční kontroly pomocí fázový kontrastní mikroskop pomocí dvou nezávislých inspektorů (oční TCID50). Studny byly považovány za infikované, pokud byla nalezena alespoň jedna zvětšená buňka. Pro oba odečtené přístupy byl TCID50 vypočítán podle vzorce Reed a Muench .
TCID50 výsledky určí Q-PCR (Q-PCR TCID50) byl ve srovnání s infekční jednotky hodnocení IFA (osobní komunikace s Louisem Flamand) na tři časové body pro P19 a jeden pro P27. Stručně řečeno, buňky 2,5 * 105 HSB-2 byly inokulovány, jak je popsáno výše, různými ředěními viru v trojitých jamkách pro každé ředění. Při dvou dpi byly buňky podrobeny IFA zaměřené na časný virový protein p41 (klon 9A5D12, Santa Cruz Biotech. As., CA), jak je popsáno výše. Virový titr, vyjádřený jako infekční jednotky na ml, byl vypočítán vynásobením frakce infikovaných buněk celkovým počtem buněk při nulovém dpi a ředicích faktorech.
pro stanovení optimálního časového bodu pro měření zvýšení virové DNA byla replikace viru sledována po dobu deseti dnů. K dosažení dostatečného zvýšení virové DNA bylo zapotřebí sedm dní (Obrázek 1), a proto byl vybrán jako časový bod sklizně. Pro nastavení bodu řezu relativního zvýšení virové DNA odpovídajícího pozitivní infekci bylo zvýšení virové zátěže DNA korelováno s expresí virového proteinu. IFA byla provedena při sedmi dpi na buňkách z každé jamky ve třech destičkách TCID50 pro dvě různé virové šarže. Optimální střih bod bylo zjištěno, že deset času, zvýšení virové DNA, kde korelace exprese proteinů byl viděn v 93% vrtů (Obrázek 2).
Replikace HHV-6A (GS kmen), následuje Q-PCR. Uvedené údaje jsou průměrné výsledky (±SEM) trojitých kultur pro každou multiplicitu infekce (MOI). Spojovací vedení se přeruší, když zátěž virové DNA klesne pod detekční limit.
Stanovení cut-bod pro infekci. Optimální cut-point pro infekci bylo zjištěno, že být desetkrát zvýšit, kde korelace exprese proteinů byl viděn v 93% studní v IFA s protilátkou cílení pozdní virový protein gp116/54/64. Žádný dobře obsažený virový protein, u kterého se virová DNA nezvyšovala desetkrát. Uvedené údaje jsou průměrné výsledky (±SEM) ze tří desek TCID50.
porovnáním hodnot Q-PCR TCID50 s očními a IFA TCID50 se jeden Q-PCR TCID50 rovnal 1,41 očním a 1,03 IFA TCID50 na základě 13 nebo 5 hodnocení. Q-PCR TCID50 nedal statisticky odlišné hodnoty v porovnání s oční nebo IFA TCID50 (p = 0.41 nebo p = 0.29, respektive) (párový t-test) (Tabulka 1).
Virové DNA kopírovat čísla jsou často používány jako hrubý odhad množství virových částic určité virové dávce obsahuje. Není však jisté, jak dobře to odpovídá infekčnosti. K posouzení byly porovnány hodnoty TCID50 s čísly kopií virové DNA pro příslušnou šarži. Průměrné poměry virové DNA zatížení pro Q-PCR TCID50 hodnoty v virus dávky byly podobné pro P17 a P19; 6.3*105 a 2,0*106 virové DNA kopií za TCID50, resp. U P21 byl však poměr podstatně vyšší, 1,3 * 108 kopií virové DNA na TCID50 (Tabulka 1). Měření virové DNA v supernatantech šarže tedy není dostatečné pro správné přiřazení infekčnosti šarže, a proto by měly být provedeny biologické testy pro přesné stanovení virových titrů.
průměrné intra-assay variační koeficient (CV) pro Q-PCR TCID50 bylo 9%, což se stanoví paralelní duplicitní extrakce a Q-Pcr tří TCID50 kultury desky. Pro oční TCID50 byl intra-test CV 45%, stanoveno celkem dvanácti kultivačními destičkami tcid50 čtenými dvěma nezávislými hodnotiteli. Intra-test CV byl 14% pro IFA TCID50 stanoveno dvěma paralelními barveními buněk ze dvou sérií. Pro přístup k infekčním jednotkám byl intra-test CV 43% stanoven čtyřmi paralelními barveními buněk z jednoho běhu. Průměrný interval CV byl 73% Pro Q-PCR TCID50 a 66% pro oční TCID50, stanoveno pro tři virové šarže po pěti, třikrát a třikrát. Pro IFA TCID50 byl interval CV 25%, stanovený pro jednu dávku třikrát. Pro přístup k infekčním jednotkám byl CV mezi testy 77%, stanoveno třemi samostatnými sériemi pro jednu šarži.
Stručně řečeno, zde popsaná metoda Q-PCR TCID50 dobře koreluje s expresí virových proteinů a má tedy vysokou specificitu pro infekční dávku. Je robustnější než oční tcid50, IFA TCID50 a přístup infekčních jednotek na základě hodnot CV uvnitř testu. Intra-assay CV je v tomto nastavení měřítkem toho, jak přesné a určité číst-out přístup, a proto je nejpřesnější hodnotu pro porovnání různých metod. Pro přizpůsobení metody je třeba stanovit bod řezu pro každý testovaný virový kmen a každou použitou buněčnou linii. Přístup čtení Q-PCR je pracnější než oční kontrola,ale podle našeho názoru podstatně méně pracný než přístup IFA TCID50 a infekčních jednotek. Je to dražší z hlediska laboratorních zdrojů než oční kontrola, IFA TCID50 a přístup infekčních jednotek. Naše data však zdůrazňují důležitost provádění biologických testů k přesnému určení virových titrů, což by mohlo vyžadovat náklady a práci. Kromě toho by lepší standardizace metod hodnocení titrů virů používaných v poli HHV-6 mohla zvýšit shodu mezi různými studiemi.