Western blotting test označený kinázovou aktivitou

akumulační důkazy naznačují, že narušení signalizace fosforylace / defosforylace je spojeno s patologickým chováním buněk. Projekty fosfoproteomu identifikovaly téměř 300 000 fosforylovaných zbytků ser/Thr / Tyr v buněčných proteinech . Souběžně projekt lidského genomu odhalil přibližně 500 proteinových kináz. Přesto bylo každému místu fosforylace přiděleno omezené množství proteinkináz.

in-gel fosforylační test byl vhodnou metodou pro detekci aktivity proteinkinázy ve vzorcích solubilizovaných SDS. Tato metoda byla použita pro identifikaci CaMKII, MYPT1-K (nebo ZIPK) a dalších . V této zkoušce protokol, protein kinázy jsou naloženy na SDS-polyakrylamidovém gelu s vestavěnými substrát polypeptid, a potom se podrobí renaturation, fosforylace pomocí radioaktivního ATP, následuje autoradiografie detekovat hladinu fosforylovaného substrátu. Kromě toho byla detekována autofosforylace kináz na membráně nitrocelulózy nebo polyvinylidenfluoridu (PVDF) za použití radioaktivního ATP . Radioaktivní materiál může být pro uživatele omezením kvůli bezpečnostním předpisům. Autoradiogramy fosforylovaných proteinů navíc postrádají informace o fosforylačních místech.

zde jsme optimalizovali neradioaktivní alternativní test k tradičnímu fosforylačnímu testu v gelu. Jménem kinázy-tagged western blotting (KAT-WB), úspěšně detekuje Tyr-kinázy, které autophosphorylate sami, stejně jako Ser/Thr-kinázy, které fosforylují substrátem proteinu zájmu v konkrétním místě pomocí fosfo (P)-specifické protilátky.

Obrázek 1 ukazuje údaje KAT-WB pro test Autofosforylace Tyr-kinázy. Aby se duplicitní skvrny, dva alikvotní podíl extraktu byly naloženy na SDS polyakrylamidovém gelu, podroben elektroforéze a pak bílkoviny byly převedeny na list z PVDF membrána (0,2 µm). Membrána byla postupně ošetřena pufrovaným 2-propanolem, 6,0 M hydrochloridem guanidinu (Gu-HCl), 3,0 M Gu-HCl, 0,1 M Gu-HCl a renaturačním pufrem(viz doplňkový protokol). Po nočním renaturačním kroku při 4°C byla membrána podélně řezána, aby se vytvořily dva duplicitní kusy (Obrázek 1). Jeden kus membrány byl inkubován po dobu 60 minut s 1 mM MgATP. Druhý kus membrány byl inkubován bez mgatp, jako kontrola. Oba listy byly současně podrobeny imunodetekci protilátkou anti-P-Tyr (klon PY20 při ředění 1:5000). Jak je znázorněno na obrázku 1, bylo detekováno více pásem P-Tyr při 100, 70, 45 a 35 kDa v kontrolní membráně (vlevo nahoře). Tyto P-Tyr proteiny byly pravděpodobně již fosforylovány před extrakcí. Inkubace s MgATP po oddělení zvýšené Tyr fosforylace proteinu na 45 kDa v srdečním svalu lyzáty (Obrázek 1, vpravo nahoře, lane 2), což naznačuje, autophosphorylation Tyr zbytků v této kinázy na membránu následující renaturation. Obrázek 1 ukazuje denzitogramy pruhu 2 (- /+ MgATP). Pro ověření ekvivalentního zatížení proteinu na obou blotech byly filtry podrobeny barvení Coomassie (Obrázek 1, dole). Technická poznámka je, že v průběhu vývoje metody, zjistili jsme, že ošetření s pufrovaného 2-propanol a 6M Gu-HCl byly nezbytné pro detekci aktivity kinázy. Proto kat-WB detekoval 45-kDa Tyr kinázu.

Další verze KAT-WB používá site-specifické fosforylace substrátu protein vstřebává na PVDF membránu v blízkosti kinázy. Použili jsme fosfatázy holoenzyme inhibitor-1 (PHI-1) jako protein zájmu, jehož fosforylace na Thr57 převádí tento buněčný protein inhibitor typ 1 Ser/Thr fosfatázy . Obrázek 2A ukazuje, KAT-WB dat pomocí jako pozitivní kontrola rekombinantní ZIPK, Ser/Thr kinázy známo, že fosforylují rekombinantní PHI-1 na Thr57 . Po denaturaci a postupně renaturation proces, membrány, bylo namočené přes noc ve 4°C v renaturation tlumivý roztok s rekombinantní PHI-1 divokého typu (WT), nebo nonphosphorylatable verze (T57H) na 0,2 mg/ml, a pak fosforylace reakce byla běh s MgATP. Fosforylovaný PHI-1 na membráně byl detekován pomocí anti-P-PHI-1 (Thr57) protilátky , což odhalilo pásmo rekombinantního ZIPK. Na řídicích membránách byl však detekován pouze slabý signál bez PHI-1 nebo s verzí PHI-1 T57H. Tyto údaje naznačují, že renaturované kinázy na membráně jsou schopny fosforylovat substráty, které jsou také absorbovány na membránu. KAT-WB byl aplikován k detekci více kináz PHI-1 v tkáních a buňkách (obrázek 2B). Extrakty z krysích kosterních, srdečních svalů a buněk Neuro2a byly podrobeny testu KAT-WB. Ve srovnání s ne-ATP ovládání (vlevo, nahoře), signály P-PHI-1 objevil na blot inkubovány s 1 mM MgATP (vpravo, nahoře). Prominentní pásy P-PHI-1 byly detekovány v buněčných Lyzátech Neuro2a při 100, 60 a 49 kDa (pruh 3, otevřená šipka). V pruhu s extrakty kosterních a srdečních svalů (pruhy 1 a 2)však nebyly patrné žádné pásy pro P-PHI-1. Signál P-PHI-1 nebyl zesílen fosforylačním krokem bez PHI-1 (Obrázek 2, dole, prázdný: BLK). Tyto výsledky ukazují, že existuje více kináz PHI-1 exprimovaných v neuronálních buňkách, ale ne v kosterních nebo srdečních svalech. To nám poskytuje výkonný nástroj pro detekci více kináz specifických pro substrát v buňkách a tkáních. Technická poznámka je, že přes noc renaturation s PHI-1 bylo nutné pro detekci fosforylace signály, a že vyšší koncentrace PHI-1 nevedla ke zvýšení intenzity barvení (není zobrazeno).

na Základě těchto údajů, můžeme navrhnout, že KAT-WB je schopen detekovat autophosphorylation Tyr kinázy a site-specifické fosforylace selektivní substrát bílkoviny zájmu o více proteinových kináz přítomné v tkáních a buňkách. KAT-WB v podstatě sdílí výhody tradičního v-gel fosforylace test, který detekuje kinázy činnosti v surové směsi, jako jsou buněčné extrakty, odhalení jejich molekulární velikosti . Další výhodou těchto dvou testů je, že post-translační modifikací (PTMs) kináz v buňkách může být zachována v požadovaném čase za určitých podmínek, protože vzorky pro tyto testy jsou rychle denaturované, s vyrovnávací paměti, včetně SDS, což eliminuje fosforylace a dephosphorylation v extraktech . Většina proteinových kináz je regulována pomocí PTM. KAT-WB je schopen sledovat fluktuace v aktivitách kinázy, i když regulační PTM ještě nebyly charakterizovány. KAT-WB není schopen detekovat každou kinázu v buněčných extraktech, protože pouze monomerní enzymy, které účinně renaturují za použitých podmínek, vykazují aktivitu. Modifikace KAT-WB by však měly být schopny detekovat kinázy regulované kalmodulinem a cykliny, jak to bylo provedeno fosforylačním testem v gelu . Zlepšení účinnosti renaturace a kombinace s imunoprecipitací/imunodeplecí protilátkami na kinázy může rozšířit užitečnost tohoto přístupu.

je pozoruhodné, že, kromě fosforylace, princip KAT-WB protokolu může být použita pro detekci jiných PTM enzymy, jako acetylases, methylases a ubiquitin ligázy, když PTM-specifických protilátek jsou k dispozici. Spolu s vývojem protilátek, které rozpoznávají místně specifické PTM, výzkumné cíle, na které se vztahuje západní blotování označené aktivitou, budou rozšířeny.