Hæmoglobinaffinitet for ilt i tre underarter af padder (Bufo sp.) bor i forskellige højder
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 laboratorium for automatik, Chile
2 laboratorium for transport af ilt, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, pr. liter
3 Universidad Arturo Prat, Chile
abstrakt
blod ILTAFFINITET og røde BLODLEGEMEGENSKABER blev målt i tre underarter af slægten Bufo: bufo spinulosus limensis, opsamlet ved havniveau og ved en gennemsnitlig dagtemperatur på 20; Bufo spinulosus trifolium, fra 3100 m, gennemsnitlig dagtemperatur på 15 liter; og Bufo spinulosus flavolineatus, fra 4100 m, gennemsnitlig dagtemperatur på 10 liter. Elektroforese af hæmoglobinet viste den samme komponent i hver af de tre underarter. Ved 20 liter viste iltaffiniteten i blodet (P50) små forskelle mellem Bufo spinulosus limensis og Bufo spinulosus trifolium, mens værdien for Bufo spinulosus flavolineatus var markant lavere. Ved 10 liter, omgivelsestemperaturen for Bufo spinulosus flavolineatus, var P50 ekstremt lav sammenlignet med de to andre underarter ved deres tilsvarende omgivelsestemperaturer.
nøgleord: tilpasninger, højde, amfibier, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, hæmoglobinaffinitet, hæmatokrit, iltbinding, padder
introduktion
i Peru indtager slægten Bufo en højdegradient, der spænder fra havets overflade til over 4000 m. Arten Bufo spinulosus har tre underarter, hvis nicher er i lave, mellemliggende og høje højder. Disse underarter er Bufo spinulosus limensis (lav højde), Bufo spinulosus trifolium (mellemhøjde) og Bufo spinulosus flavolineatus (høj højde) (12). En af de mest intensivt studerede miljøtilpasninger af åndedrætssystemet hos hvirveldyr er hypoksi, der forekommer forskelligt i høj højde, i embryonal udvikling (f.eks. Disse tilpasninger involverer almindeligvis ændringer i egenskaberne af de røde celler, i iltbærende kapacitet eller i hæmoglobins iltaffinitet. Intraspecifikke tilpasninger, der forekommer hos det samme dyr under forskellige betingelser, involverer generelt ændringer i allosteriske faktorer (dvs.betingelserne, under hvilke hæmoglobinet fungerer inde i de røde celler), mens interspecifikke tilpasninger, som er tydelige ved sammenligning af forskellige arter, kan tilskrives ændringer i hæmoglobinmolekylernes egenskaber.
de fleste undersøgelser af hypoksiske tilpasninger i røde blodlegemer og hæmoglobinegenskaber henviser til fisk og pattedyr, og meget lidt vides om lavere ektotermiske hvirveldyr. En tidligere undersøgelse viste, at søen Titicaca frøen Telmatobius culeus (2) lever på 3800 m. havde højere blod O2 affinitet og mindre blodlegemer end havniveau frøer. Denne undersøgelse beskriver tilpasningerne i Bufo-underarter.
materiale og metoder
Anuraner af underarten Bufo spinulosus limensis blev opsamlet fra kystsletterne på cirka 400 km fra vores laboratorium i Lima (havniveau, gennemsnitlig dagtemperatur 20 liter). Bufo spinulosus trifolium blev opsamlet i de centrale peruvianske Andesbjerge (ca.3100 m, gennemsnitlig dagtemperatur 15 liter) og Bufo spinulosus flavolineatus også i de centrale Andesbjerge (ved 4100 m, gennemsnitlig dagtemperatur 10 liter). Dyrene blev bragt til vores laboratorium inden for få timer. Blod blev trukket i hepariniserede sprøjter fra hjerterne hos tidligere pithed dyr. 3 ml blod kunne opnås fra Bufo spinulosus limensis og 1 til 1, 5 ml fra de andre underarter. Blod fra to til tre dyr blev samlet for at udføre bestemmelserne. Røde blodlegemer, hæmoglobinkoncentration og hæmatokrit blev målt ved konventionelle teknikker.
elektroforese af hæmoglobinet blev kørt på celluloseacetatstrimler i en buffer, der var specifik for hæmoglobinelektroforese, og båndene blev farvet med Ponceau S og læst i et densitometer i henhold til Helena Laboratories (USA) instruktionsmanual.
blod-ilt-affiniteten (P50) blev målt ved blandeteknikken (1,10) ved 10 liter, 15 liter og 20 liter. Blodækvilibreringen blev udført i et tonometer opretholdt ved disse temperaturer ved anvendelse af gasblandinger indeholdende 4,5% CO2 og variable O2-og N2-koncentrationer. Blod O2 mætning varierede mellem 30 og 80%. PH-måleren blev kalibreret ved hjælp af højpræcisionsfosfatbuffere.
pH-værdierne ved ligevægtstemperaturerne blev beregnet ud fra dem ved måletemperaturer (meas) ved hjælp af ligningen givet af Rosenthal (8):
Phek = ph meas + 0,0147 (Tec _ Tmeas)
Bohr-faktoren blev opnået ved at ændre blodets pH som følger. Plasma fremstillet ud fra alikvoter blev enten syrnet med mælkesyre eller alkaliseret med natriumhydroksid og rekonstitueret med de tilsvarende røde blodlegemer. Blodprøverne fra Bufo spinulosus limensis og Bufo spinulosus trifolium blev ækvilibreret ved 20 og 15 og blodet fra Bufo spinulosus flavolineatus ved 20 og 10 og ved forskellige pH-værdier for at beregne Bohr-faktoren for hver temperatur (14). Denne faktor tillod beregningen af standard blod pH ved de tre temperaturer. For at beregne Hill ‘ s koefficient (n) blev der anvendt en metode til successive tilnærmelser (10). En værdi fra Bohr-ligningen for hver underart blev beregnet ud fra data i separate eksperimenter.
van’ t Hoff-ligningen blev brugt til at beregne den samlede iltningsvarme DH ‘ ud fra P50-værdierne. For Bufo spinulosus limensis blev der anvendt værdier ved 20 liter og 15 liter under anvendelse af 20 liter som Omgivelsestemperatur. For Bufo spinulosus trifolium blev værdierne ved 15 liter og 20 liter anvendt med 15 liter som Omgivelsestemperatur. For Bufo spinulosus flavolineatus blev værdierne ved 10 liter og 20 liter anvendt med 10 liter som Omgivelsestemperatur. Den statistiske signifikans blev bestemt af elevens t-test med System Systat 6.0 til vinduer.
resultater
tabel i og II opsummerer de hæmatologiske data. Der er ingen statistisk forskel mellem værdierne af Bufo spinulosus limensis og Bufo spinulosus trifolium. Værdierne af hæmatokrit, hæmoglobin og mængden af RBC i Bufo spinulosus flavolineatus er meget lavere.
elektroforeseforsøgene viste de samme migrationsafstande i hæmoglobinerne i hver af de tre underarter og tilstedeværelsen af to bånd i nogle af løbene (Fig. 4). Der blev ikke udført yderligere undersøgelser for at definere hæmoglobinegenskaberne.
tabel II viser hæmoglobins funktionelle egenskaber i blod og afslører små forskelle i P50 mellem Bufo spinulosus limensis og Bufo spinulosus trifolium, mens værdien for Bufo spinulosus flavolineatus er lavere. Værdierne ved den omgivende temperatur, hvor dyrene blev opsamlet, varierede ikke signifikant mellem Bufo spinulosus limensis og Bufo spinulosus trifolium. I tilfælde af Bufo spinulosus flavolineatus er P50-værdien meget lav ved 10 liter. Figur 1 viser et plot af log P50 vs. pH. figur 2 viser hæmoglobin ilt dissociationskurver konstrueret med værdierne af P50 og Hill ‘ s koefficient ved 20 liter C. kurverne for Bufo spinulosus limensis og Bufo spinulosus trifolium er meget tæt på hinanden, mens det for Bufo spinulosus flavolineatus forskydes til venstre. Figur 3 er et plot af blod O2 indhold vs. blod PO2 ved omgivelsestemperaturen for hver underart. Dette viser det lave O2-indhold og meget lave P50 af Bufo spinulosus flavolineatus og en moderat forskydning til venstre for Bufo spinulosus trifolium sammenlignet med Bufo spinulosus limensis uden reduktion af blodets O2-indhold i Bufo spinulosus limensis og Bufo spinulosus trifolium.
Fig. 1: Bohr-effekt i tre underarter af Bufo spinulosus. Bufo spinulosus flavolineatus viser den største Bohr-faktor.
Fig. 2: Blooddissociations kurve for de tre underarter ved pH på 7,84 og 20 kr. Kurven for Bufo spinulosus flavolineatus forskydes til venstre.
Fig. 3: hæmoglobin O2 indhold vs delvis ilttryk for hver subspeceis ved den respektive økologiske temperatur. Bufo Spinulosus limensis (20 liter C), Bufo spinulosus trifolium (15 liter C)Bufo spinulosus flavolineatus (10 liter C). Hæmoglobinindholdet i Bufo spinulosus flavolineatus er lavere end i de to andre underarter, og P50 er meget lavt.
Fig. 4: elektroforese af de tre underarter af Bufo Spinulosus. Eksperimentet viser de samme migrationsafstande i hæmoglobinerne i hver af de tre underarter og tilstedeværelsen af to bånd i nogle af kørslerne.
disse resultater viser, at ved 20 liter Bufo spinulosus flavolineatus, hvis naturlige habitat er tæt på 4000 m, og hvis omgivelsestemperatur er i gennemsnit 10 liter, har et lavt hæmoglobinindhold og en høj hæmoglobinaffinitet sammenlignet med Bufo spinulosus trifolium, hvis gennemsnitlige omgivelsestemperatur er tæt på 3000 m, og hvis omgivende gennemsnitstemperatur er 15 liter. Bufo spinulosus limensis (havniveau) og Bufo spinulosus trifolium havde næsten identiske kurver. Hvis kurverne blev opnået ved omgivelsestemperaturerne, viste Bufo spinulosus flavolineatus et meget lavt O2-indhold og høj hæmoglobinaffinitet sammenlignet med de to andre underarter. I Bufo spinulosus flavolineatus indikerer den høje DH’ en høj følsomhed af hæmoglobinaffiniteten over for ændringer i omgivelsestemperatur, og den høje Bohr-faktor indikerer også en høj følsomhed af hæmoglobinaffinitet over for ændringer i blodets pH.
diskussion
slægten Bufo er udbredt i Andes-lande. Bufo spinulosus har tre underarter, hvis nicher er placeret i de nedre andesskråninger, de mellemliggende dale (3000 m) og de højeste sletter (over 4000 m). Mellemhøjden underarter Bufo spinulosus trifolium og havoverfladen underarter Bufo spinulosus limensis adskiller sig ikke i deres hæmatologiske værdier. Bufo spinulosus flavolineatus i høj højde har en meget lavere hæmoglobinkoncentration, men de røde cellers egenskaber ligner de to andre underarter. RBC ‘ erne ser ud til at være mindre end dem i de to andre underarter, i modsætning til Ruiss (9) fund, hvilket angav det modsatte. Det er kendt, at slægten Bufo har en højere hæmoglobinkoncentration end andre amfibier. Hutchinson og Stsarki (3) tilskriver dette den høje vaskularisering og terrestriske vane. Bufo spinulosus flavolineatus har imidlertid meget lav hæmoglobinkoncentration.
i de tre grupper viser hæmoglobinelektroforetisk undersøgelse individer, hvis elektroforetiske mønster præsenterer to klart adskilte hæmoglobinbånd. Der er ingen forskel i hæmoglobinaffiniteten mellem Bufo spinulosus trifolium og Bufo spinulosus limensis ved 20 liter, hvorimod det i Bufo spinulosus flavolineatus er højere. Når affiniteterne blev undersøgt ved de omgivende temperaturer, hvor dyrene lever, Havde Bufo spinulosus trifolium iltdissociationskurver, der skiftede moderat til venstre for Bufo spinulosus limensis, og Bufo spinulosus flavolineatus viste et meget markant skift, hvilket indikerer en meget høj hæmoglobinaffinitet.
indfødte pattedyr og fugle i høj højde har en tendens til at have høje iltaffiniteter i blodet og ikke vise polycytæmi i høj højde (5). Det ville være interessant at observere, om disse reaktioner på omgivende hypoksi og kolde forhold er til stede i ektotermiske dyr. I teorien bør kolde forhold bidrage til at øge tolerancen for høj højde, fordi det nedsætter metabolismen. I tilfælde af Bufo spinulosus flavolineatus, hvis dagtemperatur under klipper ved 4100 m er omkring 10 liter og omkring 6 liter eller mindre om natten i damme, hvor de hviler halvt nedsænket, indikerer den høje affinitet selektionstryk mod hypoksi på trods af en mulig reduktion i metabolisk hastighed. Packard og Stiverson (7) fandt ikke et forhold mellem højde og hæmoglobinkoncentration i korfrøen (Pseudacris triseriata), men højdeområdet i deres undersøgelse (1500 m og 3000 m) var lille.
hæmoglobinaffiniteten er et genetisk mærke, der tilsyneladende er valgt af det hypoksiske miljø hos hvirveldyr. Hos pattedyr og fugle er affiniteten en ret fast egenskab, der ikke stiger i hypoksi og forsvinder ikke i normoksi (6). I fisk øges blodets ilt markant under hypoksi (13).
fra et komparativt synspunkt er der nogle ligheder mellem ektotermer og endotermer. Det har vist sig, at der er en vis sammenhæng mellem hæmoglobinaffinitet og højde i underarter af mus, der indtager en højdegradient (11). Det er også blevet vist, at inden for de samme pattedyrarter, der lever langs en lodret gradient i Andesbjergene, har individer, der lever i det højeste område, hæmoglobiner med højere affinitet end individer, der lever i det laveste område. Disse forskelle var større for Andesreven, hvor to separate arter besætter de to ekstremer i højdeområdet (4).
dette arbejde styrker konceptet om, at polycytæmi ikke er valgt som en adaptiv parameter til det hypoksiske miljø. Tværtimod synes hæmoglobin med høj affinitet at være stærkt udvalgt i en række dyr, der lever i høj højde.
anerkendelser
vi takker Dr. Roy E. Uber for hans hjælp til at afklare vores tænkning om dette emne og for at gennemgå manuskriptet.
Tilsvarende Forfatter: Hrvoj Ostojic P. – Clinicum Laboratorio Automaticado, Casilla 169, Chile. Telefon: (56-57) 420599, telefonnummer: (56-57) 427683, e-mail: [email protected]
modtaget: 13.August 1999. Accepteret i revideret form: 6. maj 2000
bibliografi
1. MJ, MARTIN RJ (1966). Blanding teknik til ilt-hæmoglobin ligevægt og Bohr effekt. J Appl Physiol 21:1898-1902
2. HUTCHINSON VH, HAINES HB, ENGEBRETSON G (1976) vandlevende liv i høj højde: Åndedrætstilpasninger i søen Titicaca frog, Telmatobius culeus. Respir Physiol 2: 115-119.
3. Hutchinson VH (1965) antal røde blodlegemer i nogle padder og krybdyr. Copeia: 373-375
4. LEON-VELARDE F, de MUISON C, PALACIOS JA, CLARK D, MONGE-C C (1996) Hæmoglobinaffinitet og struktur i kødædende dyr i høj højde og havniveau fra Peru. Comp Biochem Physiol 113a:407-411
5. MCCUTCHEON FH HALL FG (1937) hæmoglobin i amfibien. J Celle & Comp Physiol 9:191-197
6. MONGE C, LEON-VELARDE F (1991) fysiologisk tilpasning til høj højde: ilttransport hos pattedyr og fugle. Physiol Rev 71: 1135-1172
7. PACKARD G C STIVERSON RK (1976) blod hæmoglobinkoncentration i chorus frog (Pseudacris triseriata): forhold til kropsstørrelse og højde. Am Midl Nat 96: 482-487
8. ROSENTHAL TB (1948) effekten af temperatur på pH i blod og plasma in vitro. J Biol Chem 173:25-30
9. Ruis G, ROSENMANN M, VELOSO A. (1989) Højdefordeling og blodværdier i padden, Bufo spinulosus Viegmann. Comp Biochem Physiol 94A: 643-646
10. SCHEID P, MEYER M (1978) blandingsteknik til undersøgelse af ilt-hæmoglobinbalance: en kritisk evaluering. J Appl Physiol 45: 818-822
11. SNYDER GK, sort CP, BIRCHARD GF (1982) udvikling og metabolisme under hypoksi i embryoner af høj højde Anser indicus versus havniveau Branta canadensis gæs. Physiol 55:113-123
12. VELLARD J (1959) Estudios sobre batracios andinos V: el g Larsen Bufo. Mem Hist Nat Javier Prado N Til 8
13. (1992) molekylære strategier i tilpasningerne af hvirveldyr hæmoglobin funktion i: træ SC, HARGENS AR, MILLARD RV (eds) Physiol tilpasninger i hvirveldyr, Ny York: Marcel dekker
14. RM, MORRISSEY JM, BERGER RL, SMITH PD, GIBSON CC (1978) variabilitet af iltaffinitet af normalt blod: en automatiseret målemetode. J Appl Physiol: Respirat Environ Motion Physiol 45 (2): 289-297