Bei experimentellen Arbeiten mit Viren ist die Kontrolle des Virustiters von entscheidender Bedeutung. Um Vergleiche zwischen Studien zu erleichtern, die in verschiedenen Laboratorien durchgeführt wurden, ist die Verwendung harmonisierter Standardmethoden wünschenswert. Für das humane Herpesvirus 6 (HHV-6) , ein β-Herpesvirus, dem die meisten Menschen ausgesetzt waren , wird häufig die Methode der 50% igen Gewebekulturinfektivitätsdosis (TCID50) zur Beurteilung des Virustiters verwendet. Ein häufig verwendetes Auslesen ist die okuläre Inspektion auf zytopathische Effekte (CPE), d. H. Vergrößerung der infizierten Zellen . Ein Hindernis bei diesem Ansatz besteht darin, dass sich Zellen vergrößern können, selbst wenn sie nicht infiziert sind. Besonders schwierig ist dies an der Infektionsgrenze in Titrationsreihen, da sich durch Infektion vergrößerte Zellen mit zunehmender Verdünnung des Virus tendenziell weniger vergrößern (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1). Der Immunfluoreszenz-Assay (IFA) ist ein alternativer Ausleseansatz zur okulären Inspektion bei der TCID50-Beurteilung oder zur Berechnung infektiöser Einheiten, d. H. Des Anteils infizierter Zellen . Das IFA-basierte Auslesen unterscheidet infizierte von nicht infizierten Zellen deutlicher, aber die Färbung ist mühsam und eine beträchtliche Anzahl von Zellen muss gezählt werden, um zuverlässige Werte zu erhalten. Die Überwachung einzelner Zellen birgt das Risiko, die Positivität einer Zelle falsch zu interpretieren, ein Nachteil sowohl der Augeninspektion als auch der IFA-basierten Auslesung. Daher haben wir einen alternativen Ausleseansatz von TCID50 entwickelt und validiert, bei dem der Anstieg der viralen DNA-Belastung in jeder Titrationsbohrung von TCID50-Kulturplatten mittels quantitativer Echtzeit-PCR (Q-PCR) gemessen wird. Dieser Ansatz wurde mit der Augeninspektion und dem IFA-Auslesen von TCID50 und mit dem oben beschriebenen Ansatz für infektiöse Einheiten verglichen.
HHV-6A (GS-Stamm) wurde in der T-Zelllinie HSB-2 in GlutaMAX enthaltendem RPMI 1640 Medium (Invitrogen, United Kingdom) vermehrt, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (HyClone, UT), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (Invitrogen). Wenn etwa 50% der lebenden Zellen vergrößert waren, wurde der Überstand geerntet und sofort in Aliquots bei -80 ° C bis zur Analyse eingefroren. Als Kontrollen wurden Virusüberstände der Passage 17 (P17) durch UV-Licht für 20 min oder durch Wärmebehandlung bei 56°C für 1 h inaktiviert. Die HHV-6A-Replikation in HSB-2-Zellen wurde wie zuvor beschrieben zehn Tage lang mittels Q-PCR (Applied Biosystems, United Kingdom) verfolgt. Vor der Q-PCR-Analyse wurde DNA aus den Zellsuspensionen unter Verwendung eines 96-Well-Platten-Bead-basierten Kits gemäß dem Herstellerprotokoll (MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit, Applied Biosystems) extrahiert. Zur Beurteilung des HHV-6A-DNA-Gehalts in den viralen Ansätzen wurde nach DNA-Extraktion mittels Filtersäulen (QIAGEN GmbH, Deutschland) wie oben beschrieben eine Q-PCR durchgeführt.
Zum Aufbau der TCID50-Kulturplatten wurden Zellsuspensionen von 40 µl 104 HSB-2-Zellen pro Well in Rundboden-96-Well-Kulturplatten ausgesät. Die Zellen wurden 3-4 Stunden mit 160 µl fünffacher Verdünnung von HHV-6A-Überstand inokuliert, sechs Replikate pro Verdünnung. Mock- und Medium-Kontrollen wurden in dreifachen Vertiefungen auf allen Platten enthalten. Die Zellen wurden einmal gewaschen, bevor 50-70 µl Zellsuspension aus jeder Vertiefung entnommen und bei -80 ° C als dpi-Proben (Zero Day Post Infection) gelagert wurden. Die restlichen Zellsuspensionen wurden sieben Tage bei 37°C inkubiert. Bei sieben dpi wurden die aufgetaute Null-dpi-Platte und die sieben dpi-Platten einer DNA-Extraktion unter Verwendung des oben beschriebenen Bead-basierten Kits unterzogen. Danach wurde die virale DNA wie oben beschrieben mittels Q-PCR quantifiziert.
Für IFA wurden die Zellen mit einem 1:1-Gemisch aus Aceton und Methanol bei -20 °C für 10 Minuten auf Objektträger fixiert, mit 5% Ziegenserum und 3% BSA in PBS blockiert und mit einem primären monoklonalen Mausantikörper gefärbt, der spezifisch für das HHV-6-Glykoprotein gp116/54/64 (Advanced Biotechnologies, MD) ist. Die Färbung wurde durch ein Alexa 633 konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (Invitrogen) visualisiert. Zur Visualisierung der Zellkerne wurde eine Färbung mit 4′,6-diamidino-2-phenylindol (Vector laboratories, CA) verwendet. Deckblätter wurden mit Trägermedien (DAKO A/S, Dänemark) montiert und die Objektträger mit einem konfokalen Mikroskop (Leica Microsystems, Deutschland) analysiert. Der Anteil der infizierten Zellen wurde durch manuelle Zählung bestimmt. Wenn ≥1/3 der Zellen virales Protein enthielten, wurden ≥25 Zellen pro Well gezählt und wenn < 1/3 der Zellen virales Protein enthielten, wurden ≥100 Zellen pro Well gezählt. Wells, in denen ≥2% der positiv gefärbten Zellen als infiziert galten. Der Grad der Erhöhung der viralen DNA-Last in jeder Vertiefung wurde mit der IFA korreliert, indem eine Formel in der Software Excel (Microsoft, WA) erstellt wurde. Diese Formel fragt, ob die virale DNA in einer bestimmten Vertiefung in der TCID50-Platte eine bestimmte Anzahl von Malen verschoben hat, die eingestellt ist, und ob dieselbe Vertiefung in IFA positiv war oder nicht.
Zum Vergleich mit der Q-PCR-Auslesung wurden alle TCID50-Platten durch okuläre Inspektion mit einem Phasenkontrastmikroskop von zwei unabhängigen Inspektoren (ocular TCID50) beurteilt. Wells wurden als infiziert angesehen, wenn mindestens eine vergrößerte Zelle gefunden wurde. Für beide Ausleseansätze wurde der TCID50 nach der Reed- und Münch-Formel berechnet.
Die durch Q-PCR (Q-PCR TCID50) ermittelten TCID50-Ergebnisse wurden zu drei Zeitpunkten für P19 und einen für P27 mit der Beurteilung infektiöser Einheiten durch IFA (persönliche Kommunikation mit Louis Flamand) verglichen. Kurz gesagt, 2,5 * 105 HSB-2-Zellen wurden wie oben beschrieben mit verschiedenen Virusverdünnungen in Dreifachvertiefungen für jede Verdünnung inokuliert. Bei zwei dpi wurden die Zellen einer IFA unterzogen, die auf das frühe virale Protein p41 abzielte (Klon 9A5D12, Santa Cruz Biotech. Inc., CA) wie oben beschrieben. Der Virustiter, ausgedrückt als infektiöse Einheiten pro ml, wurde berechnet, indem der Anteil infizierter Zellen mit der Gesamtzahl der Zellen bei dpi Null und Verdünnungsfaktoren multipliziert wurde.
Um den optimalen Zeitpunkt für Messungen der Viruslast zu bestimmen, wurde die Virusreplikation zehn Tage lang verfolgt. Sieben Tage waren erforderlich, um einen ausreichenden Anstieg der viralen DNA zu erreichen (Abbildung 1) und wurde daher als Erntezeitpunkt gewählt. Um den Schnittpunkt der relativen viralen DNA-Zunahme entsprechend der positiven Infektion einzustellen, wurde die Erhöhung der viralen DNA-Belastung mit der viralen Proteinexpression korreliert. Die IFA wurde bei sieben dpi an Zellen aus jeder Vertiefung in drei TCID50-Platten für zwei verschiedene Viruschargen durchgeführt. Der optimale Schnittpunkt war ein zehnfacher Anstieg der viralen DNA, wobei die Korrelation zur Proteinexpression in 93% der Wells beobachtet wurde (Abbildung 2).
Replikation von HHV-6A (GS-Stamm) gefolgt von Q-PCR. Die angegebenen Daten sind mittlere Ergebnisse (± SEM) von Triplikatkulturen für jede Multiplizität der Infektion (MOI). Verbindungslinien brechen ab, wenn die virale DNA-Last unter die Nachweisgrenze fällt.
Bestimmung des Cut-Point für die Infektion. Der optimale Cut-Point für eine Infektion war ein zehnfacher Anstieg, bei dem die Korrelation zur Proteinexpression in 93% der Wells von IFA mit einem Antikörper gegen das späte virale Protein gp116 / 54 /64 beobachtet wurde. Kein gut enthaltenes virales Protein, bei dem die virale DNA-Last nicht zehnmal zugenommen hatte. Die gezeigten Daten sind mittlere Ergebnisse (± SEM) von drei TCID50-Platten.
Vergleicht man die Werte von Q-PCR TCID50 mit Ocular und IFA TCID50, entsprach ein Q-PCR TCID50 1,41 ocular und 1,03 IFA TCID50 basierend auf 13 bzw. 5 Bewertungen. Q-PCR TCID50 ergab keine statistisch unterschiedlichen Werte im Vergleich zu okulärem oder IFA-TCID50 (p = 0,41 bzw. p = 0,29) (gepaarter t-Test) (Tabelle 1).
Virale DNA-Kopienzahlen werden häufig als grobe Schätzung der Menge an Viruspartikeln verwendet, die eine bestimmte Viruscharge enthält. Es ist jedoch ungewiss, wie gut dies der Infektiosität entspricht. Um dies zu beurteilen, wurden TCID50-Werte mit den viralen DNA-Kopienzahlen für die jeweilige Charge verglichen. Die durchschnittlichen Verhältnisse der viralen DNA-Belastung zu den Q-PCR-TCID50-Werten in den Viruschargen waren für P17 und P19 ähnlich; 6,3 * 105 bzw. 2,0 * 106 virale DNA-Kopien pro TCID50. Für P21 war das Verhältnis jedoch deutlich höher, 1,3 * 108 virale DNA-Kopien pro TCID50 (Tabelle 1). Daher reicht die Messung der viralen DNA in den Überständen der Charge nicht aus, um die Infektiosität einer Charge korrekt zuzuordnen, und daher sollten biologische Tests durchgeführt werden, um die Virustiter genau zu bestimmen.
Der durchschnittliche Intra-Assay-Variationskoeffizient (CV) für Q-PCR TCID50 betrug 9%, bestimmt durch parallele Doppelextraktionen und Q-PCRs von drei TCID50-Kulturplatten. Für ocular TCID50 betrug der Intra-Assay-CV 45%, bestimmt durch insgesamt zwölf TCID50-Kulturplatten, die von zwei unabhängigen Assessoren gelesen wurden. Der Intra-Assay-CV betrug 14% für IFA TCID50, bestimmt durch zwei parallele Anfärbungen von Zellen aus zwei Läufen. Für die infektiösen Einheiten wurde der Intra-Assay-CV zu 43% durch vier parallele Anfärbungen von Zellen aus einem Lauf bestimmt. Der durchschnittliche Inter-Assay-CV betrug 73% für Q-PCR TCID50 und 66% für Ocular TCID50, bestimmt für drei Viruschargen, die jeweils fünf-, drei- und dreimal durchgeführt wurden. Für IFA TCID50 betrug der Interassay-CV 25%, bestimmt für einen Chargenlauf dreimal. Für die infektiösen Einheiten betrug der Inter-Assay-CV 77%, bestimmt durch drei separate Läufe für eine Charge.
Zusammenfassend korreliert die hier beschriebene Q-PCR-TCID50-Methode gut mit der Expression viraler Proteine und weist somit eine hohe Spezifität für die infektiöse Dosis auf. Es ist robuster als okuläres TCID50, IFA TCID50 und der Infectious Units-Ansatz, basierend auf den Intra-Assay-CV-Werten. Der Intra-Assay-CV ist in dieser Einstellung ein Maß dafür, wie genau ein bestimmter Ausleseansatz ist und ist daher der genaueste Wert für Vergleiche der verschiedenen Methoden. Um die Methode anzupassen, muss der Schnittpunkt für jeden getesteten Virusstamm und jede verwendete Zelllinie bestimmt werden. Der Q-PCR-Ausleseansatz ist aufwendiger als die Augeninspektion, aber unserer Meinung nach deutlich weniger aufwendig als IFA TCID50 und der Infectious Units-Ansatz. Es ist in Bezug auf die Laborressourcen teurer als die Augeninspektion, IFA TCID50 und der Ansatz der infektiösen Einheiten. Unsere Daten betonen jedoch, wie wichtig es ist, biologische Assays durchzuführen, um virale Titer genau zu bestimmen, was die Kosten und den Arbeitsaufwand rechtfertigen könnte. Darüber hinaus könnte eine bessere Standardisierung der im HHV-6-Bereich verwendeten Methoden zur Beurteilung des Virustiters die Konkordanz zwischen verschiedenen Studien erhöhen.