Materialien und Methoden
Duplex-DNA-Präparation. Zur Herstellung der 30-bp-Duplex-DNA-Moleküle wurden zwei Oligonukleotide mit der folgenden Sequenz und Modifikationen hybridisiert (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Das Oligonukleotid 5′-GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ wurde an seinem 5′-Ende mit Cy5 und an seinem 3′-Ende mit Cy3 markiert. Das komplementäre Oligonukleotid wurde an beiden Enden mit Biotin markiert.
Proteinexpression und -reinigung. Das Yellow fluorescent Protein (YFP) Gen im Plasmid p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (ein Geschenk von H. Lee Sweeney, University of Pennsylvania, Philadelphia) wurde mittels PCR deletiert. Das resultierende p2Bac / pFastBac-M5-CaM-Plasmid kodiert für Hühnermyosin V, das an Glu-1099 abgeschnitten ist. Ein Leucin-Reißverschluss folgte der nativen Spule, um die Dimerisierung sicherzustellen. Um die Reinigung zu erleichtern, wurde das Myosin-V-Protein N-terminal mit einem FLAG-Tag (DYKDDDDK) markiert. Zwei rekombinante Baculoviren wurden für die Proteinexpression in Sf9-Zellen erzeugt. Eines kodierte das abgeschnittene Myosin V und das Drosophila melanogaster Calmodulin, abgeleitet vom p2Bac/pFastBac-M5-CaM Plasmid. Das zweite Virus kodierte die humane essentielle leichte Kette, die aus dem Plasmid p2Bac / pFastBac-ELC stammt. Beide Viren wurden zur Koinfektion von Sf9-Zellen verwendet. Das Protein wurde wie von Sweeney et al. (20).
Calmodulin Kennzeichnung und Austausch. Calmodulin wurde wie folgt exprimiert und mit Cy3 oder Cy5 markiert: Ein einzelnes Cystein wurde in Seeigel-Calmodulin mittels der Mutation Q143C eingeführt. Dieses Calmodulin wurde in Escherichia coli exprimiert und wie in Ref. 21. Das Calmodulin wurde entweder mit Cy3-Maleinimid oder Cy5-Maleinimid (Amersham Biosciences) Stammlösungen (in DMSO) in einem 1,4-fachen Molverhältnis für 20 min markiert. Überschüssiger Farbstoff wurde durch Gelfiltration in Austauschpuffer (unten) entfernt, gefolgt von hydrophober Absorption über Nacht auf BioBeads (Bio-Rad). Der Markierungseinbau betrug 102% für Cy3-Calmodulin und 75% für Cy5-Calmodulin. Aliquots wurden bei -80°C gelagert.
Der Austausch von markiertem Calmodulin gegen Myosin V erfolgte wie beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen (22). Myosin V (150 nM) wurde mit 0,7 nM Cy3-markiertem Calmodulin und 0,8 nM Cy5-markiertem Calmodulin in Austauschpuffer (25 mM KCl/20 mM Imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) bei 22°C für 2 min inkubiert. Zum Austausch von Calmodulinen wurden 0,9 mM CaCl 2 zugegeben und 5 min bei 22°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit 7 mM EGTA gequencht. Die Reaktionsmischung wurde auf eine 100K MWCO Nanocep Ultrafiltrationsvorrichtung (Pall) aufgebracht und dreimal mit gleichen Volumina AB (unten) gewaschen, um Myosin V von überschüssigem Calmodulin zu reinigen.
Flusszellenvorbereitung. Die Durchflusszelle wurde mit einem Glasobjektträger und hochbrechenden Deckgläsern aus NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) konstruiert, die durch doppelseitiges Klebeband zusammengehalten wurden.
Für die Myosin-V-Experimente wurden 15 µl Biotin-BSA (1 mg·ml-1) für 2 min in der Durchflusszelle inkubiert, wonach 30 µl AB-Puffer (25 mM KCl/25 mM Imidazol-HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg·ml-1 BSA) durch die Durchflusszelle geleitet wurden, um diese auszuwaschen. Fünfzehn Mikroliter 0,5 mg/ml NeutrAvidin (Molekulare Sonden) wurden zu der Zelle gegeben und 2 min inkubieren gelassen, wonach eine weitere Wäsche mit AB-Puffer durchgeführt wurde. Die Flusszelle wurde mit 15 µl biotinylierten Phalloidin-Aktin-Filamenten (250 nM) für 5 min inkubiert, gefolgt von einer 100 µl Wäsche mit AB-Puffer. Schließlich wurde die Zelle mit 20 µl Bildgebungspuffer einschließlich Calmodulin-ausgetauschtem Myosin V, 5 µM Calmodulin, 300 nM ATP, einem ATP-Regenerationssystem (0,1 mg · ml-1 Kreatinphosphokinase / 1 mm Kreatinphosphat) und 0,5% (vol / vol) Triton-X 100 beladen, um die unspezifische Bindung zu reduzieren. Die Zelle wurde mit Vakuumfett versiegelt und sofort abgebildet. Die endgültige Motorkonzentration führte zu dünn dekoriertem Aktin und ermöglichte somit eine Analyse einzelner Myosin-V-Moleküle.
Für die DNA-Experimente wurden Biotin-BSA und Neutra-vidin in gleicher Weise wie für die Myosin-V-Experimente beladen, jedoch mit T50-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl) gewaschen. Nachdem die Durchflusszelle eine Neutra-vidin-Beschichtung aufwies, wurden 15 µlof dsDNA (30 nM) in T50-Puffer mit 1 mg·ml-1 BSA zugeflossen und für 2 min inkubiert, wonach 100 µl Imaging-Puffer zugeflossen wurden. Die Durchflusszelle wurde dann mit Vakuumfett versiegelt und prompt abgebildet. Die resultierende Dekoration von DNA-Molekülen auf der Oberfläche war spärlich genug, dass fluoreszierende Flecken von verschiedenen Molekülen selten überlappten.
Mikroskopaufbau. Das Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop (TIRF) wurde wie in Ref. 8 mit einigen Abwandlungen (Fig. 5, die als unterstützende Information auf der PNAS-Website veröffentlicht ist). Anregungsquellenstrahlen bei 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) und 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) wurden durch einen dichroitischen Spiegel kombiniert und auf einen Durchmesser von 7 mm ausgedehnt. Diese Quellen wurden (Brennweite = 500 mm) auf die hintere Brennebene eines Olympus 1,65 NA × 100 TIRF-Objektivs mittels einer Laserlinie fokussiert dichroitisch auf einem linearen Translationstisch, der den Mikroskopbetrieb entweder im Epifluoreszenz- oder im TIRF-Modus ermöglicht. Das Objektiv wurde unter einem geschlossenen, zweiachsigen Piezo-Nanotranslatortisch positioniert, der mit kapazitiven Sensoren zur Positionsmessung ausgestattet war (Physik Instrumente, Auburn, MA). Das aus der hinteren Apertur des Objektivs austretende reflektierte Licht wurde auf eine Quadrantenfotodiode gerichtet, um ein Signal für eine Fokusrückkopplungsschleife bereitzustellen, die den Abstand zwischen Objektiv und Probe mit einem elektrostriktiven Aktuator festklemmte (Newport, Fountain Valley, CA). Die Fluoreszenzemission wurde vom Objektiv gesammelt, durch zwei StopLine-Dünnfilm-Kerbfilter (Semrock, Rochester, NY), einen für jede Anregungsquelle, geleitet und durch ein Dual-View-Gerät übertragen, das eine gleichzeitige Abbildung der Cy3- und Cy5-Kanäle auf einer einzigen iXon DV 887 EMCCD-Kamera (Andor Technology, Belfast, Irland) ermöglichte. Alle Daten wurden mit einer Integrationszeit von 0,5 Sekunden abgebildet. Das Übersprechen zwischen den beiden Kanälen (10%) verzerrt vermutlich die Abstandsmessungen in Richtung kleinerer Werte. Unser experimenteller Fehler macht es jedoch nicht nachweisbar, wie Monte-Carlo-Simulationen zeigen, bei denen 100 Paare modellierter Bilder einzelner Fluorophore, die durch 10 nm getrennt sind, erstellt und identisch mit den DNA-Daten analysiert wurden (unten beschrieben). Simulierte Bilder fluoreszierender Punktspreizfunktionen wurden berechnet, indem eine integrierte 2D-Gauß-Intensitätsverteilung mit konstantem Hintergrund erzeugt wurde, zu der Schussrauschen hinzugefügt wurde. Die simulierten Peaks hatten die gleichen Abmessungen und das gleiche Signal-Rausch-Verhältnis wie die realen Peaks. Simulierte Daten mit 10% Übersprechen und simulierte Daten ohne Übersprechen sind durch einen Kolmogorov-Smirnov-Test nicht zu unterscheiden (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Datenanalyse. Eine Registrierungskartierung der Cy3- und Cy5-Kanäle wurde mit Fiducials durchgeführt, die aus 100-nm-Transfluosphärenkugeln (Molekülsonden) bestanden. Sie wurden bei 532 nm angeregt und emittieren mit einem breiten Emissionsspektrum. Die Perle war in unseren beiden Kanälen nachweisbar. Wir lokalisierten eine einzelne Perle, die dem Deckglas zugeordnet war, und mit unserem Piezotisch stufen wir sie nanometergenau in ein Gittermuster (mit einem Abstand von 0,5 µm) und machten bei jedem Stopp ein Bild. Das Endergebnis war ein Stapel von 312 Bildern, der den Wulst in beiden Kanälen an verschiedenen Positionen zeigt (Abb. 1a ).
Die DNA-Daten wurden mit hausgemachter Software unter Verwendung von matlab (Mathworks, Natick, MA) analysiert. Die Routine lokalisiert automatisch Spitzen im Bild, indem sie die Pixel mit hoher Intensität bestimmt, und stellt sicher, dass die umgebenden Pixel Intensitäten aufweisen, die für einen einzelnen Fluorophor erwartet werden. Bevor wir die Peaks an eine 2D-Gauß-Funktion anpassen, um ihre Mittelpunkte zu erhalten, suchen wir nach Peakpaaren. Die im Cy5-Kanal gefundenen Pixel werden auf den Cy3-Kanal abgebildet, und es wird nach Peaks in den umgebenden Cy3-Pixeln gesucht. Wenn ein Peak gefunden wird, werden der Cy5-Peak und der Cy3-Peak für die weitere Analyse als Paar betrachtet. Jeder Peak wird an eine 2D-Gaußsche Funktion in seinem jeweiligen Raum angepasst, wie für die Perlen oben beschrieben (Gl. 1 ). Der Fehler an der mittleren Position der Anpassung wird mit der Anzahl der gesammelten Photonen (Ny) berechnet, 
Die Position des Cy5 wird dem Cy3-Kanal zugeordnet und der Abstand zwischen ihnen wird berechnet. Nach der rechnerischen Analyse der DNA-Daten wurden die identifizierten Fluorophorpaare manuell gescreent, um sicherzustellen, dass die Paare nicht in der Nähe anderer Fluorophore waren, die die Analyse der Paare gestört hätten.
Die Myosin-V-Daten wurden analysiert, indem zunächst ein beweglicher Motor mit dem Auge identifiziert wurde. Hausgemachte Software, die in matlab geschrieben wurde, passte dann das Startpaar fluoreszierender Peaks wie oben beschrieben an 2D-Gauß-Funktionen an und verfolgte die Peaks so lange, wie der Benutzer angegeben hatte. Motoren, deren konjugierte Farbstoffe jeweils in einem einzigen Schritt photogebleicht wurden, wurden analysiert, wie dies bei den meisten beobachteten Motoren der Fall war, was sicherstellte, dass wir tatsächlich Motoren mit nur einem Cy3-Label und einem Cy5-Label untersuchten. Die resultierenden Trajektorien wurden registriert, indem die Cy5-Trajektorie auf den Cy3-Kanal abgebildet wurde. Eine lineare Anpassung der kleinsten Quadrate an die Punkte beider Trajektorien ergab die Ausrichtung des Aktinfilaments, auf das die Trajektorien projiziert wurden. Die Abstände entlang der linearen Anpassung (das Aktinfilament) wurden gegen die Zeit aufgetragen, um die relativen Abstände der Köpfe zu sehen (Abb. 4).
Zeitspur eines differentiell markierten Myosin-V-Moleküls, das entlang eines Aktinfilaments läuft. Die Markierungen (Cy3 und Cy5) sind kovalent an Calmoduline gebunden, die an das Myosin-V-Molekül ausgetauscht wurden. In dieser Spur machen beide Standorte der Fluoreszenzsonde 72-nm-Schritte, was darauf hinweist, dass die Calmoduline in der Nähe der Motordomäne ausgetauscht wurden. Die wechselnden Positionen der Sonden ermöglichen eine direkte Beobachtung des Hand-über-Hand-Gehmechanismus von Myosin V.