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Pseudomonas aeruginosa ist ein allgegenwärtiges gramnegatives Umweltbakterium, das in Boden und Wasser vorkommt. Es ist auch ein opportunistischer Erreger, der Infektionen bei Personen mit angeborenen Immundefekten verursacht, einschließlich Patienten mit Mukoviszidose (CF) (8). P. aeruginosa trifft auf sauerstoffarme Umgebungen in Boden und Wasser. Es gibt Hinweise darauf, dass sich Bakterien beim Menschen mit CF zumindest teilweise in einer sauerstoffarmen Umgebung in mukopurulenten Massen oder Biofilmen in den Atemwegen befinden können (19). P. Aeruginosa kann in Gegenwart von terminalen Elektronenakzeptoren wie Nitrat (NO3−), Nitrit (NO2−) und Lachgas (N2O) anaerob wachsen oder wenn L-Arginin ein Substrat für das Wachstum ist (21). Der CF-Atemwegsschleim ist ausreichend reich an NO3− und NO2 -, um das anaerobe Wachstum von P. aeruginosa zu unterstützen (7, 19). In dieser Studie wurde ein Vergleich des P. aeruginosa-Proteoms während des Wachstums in Gegenwart und Abwesenheit von Sauerstoff durchgeführt.

P. der Aeruginosa-Stamm PAO1, der von Steve Lory (Harvard Medical School, Boston, MA) erhalten wurde, wurde in 125-ml-Flaschen in Luriabrühe (LB), ergänzt mit 1% KNO3, unter Schütteln bei 200 U / min bei 37 ° C für aerobes Wachstum gezüchtet. Das anaerobe Wachstum wurde wie zuvor beschrieben (9) in 80 ml Medium in 100 ml Wheaton-Serumflaschen (Fisher Scientific) mit Gummistopfen abgeschlossen. Dem Medium wurde Sauerstoff entzogen, indem es 1 h lang mit N 2-Gas geblasen wurde. Sowohl für aerobe als auch für anaerobe Bedingungen wurden Bakterien in der späten logarithmischen Wachstumsphase geerntet, wobei die Zelldichte (optische Dichte bei 600 nm) der anaeroben Kultur 44% der Dichte der aeroben Kultur betrug. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den pH-Werten der geernteten Kulturen (pH 7,6 für die anaerobe Kultur und pH 7,4 für die aerobe Kultur). Gleiche Mengen an denaturiertem und reduziertem Ganzzellprotein (2.0 mg aus jedem Wachstumszustand) wurden entweder mit leichtem (12C) oder schwerem (13C) spaltbarem isotopencodiertem Affinitäts-Tag (ICAT)-Reagenz (Applied Biosystems, Foster City, CA) markiert, verarbeitet und wie zuvor beschrieben analysiert (3). Die gemeldeten Daten sind die Durchschnittswerte von mindestens zwei unabhängigen Experimenten.

Sechshundertzehn P. aeruginosa-Proteine wurden mit ICAT identifiziert und quantifiziert (eine vollständige Liste der Proteine finden Sie in Tabelle S1 im Supplemental Material). Unter 151 Proteinen, deren Häufigkeit sich während des anaeroben Wachstums änderte, waren 76 häufiger (Tabelle (Tabelle 1) 1) und 75 seltener (Tabelle (Tabelle 2).2). Wie erwartet wurden 13 Proteine, die am anaeroben Wachstum und der Denitrifikation beteiligt sind (einschließlich Produkte von nir-, nos- und nar-Genen), während des anaeroben Wachstums in höheren Konzentrationen exprimiert (Tabelle (Tabelle 1).1). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die beobachteten Veränderungen des Proteingehalts auch solche umfassen, die sich speziell aus dem Wachstum bei unterschiedlichen Sauerstoffgehalten ergeben.

Die Veränderungen im nachgewiesenen Proteom könnten auch Unterschiede in allen dichteabhängigen Regulationen zusätzlich zu Effekten der Sauerstoffspannung widerspiegeln, da die relative Zelldichte der geernteten anaeroben Kultur niedriger ist. Tatsächlich werden 29 Proteine, die in anaerob gewachsenen Zellen in geringerer Häufigkeit nachgewiesen wurden, von Genen kodiert, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie Quorum-Sensing-induziert sind (5, 16, 17). Dazu gehören die Cyanwasserstoffsynthase-Untereinheiten HcnB und HcnC; das Pseudomonas-Chinolon signalisiert die biosynthetischen Enzyme PqsB, PqsC und PqsD; und PhnB (Tabelle (Tabelle 2).2). In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen wurde auch festgestellt, dass hcn- und pqs-Gene während des anaeroben Wachstums durch eine kürzlich durchgeführte DNA-Microarray-Analyse unter Verwendung von aeroben und anaeroben Kulturen, die bei derselben Zelldichte geerntet wurden, transkriptionell unterdrückt wurden (1) (Tabelle (Tabelle 22).

Zur Identifizierung von sekretiertem P. aeruginosa-Proteine mit veränderten Konzentrationen während des anaeroben Wachstums, Kulturüberstandproteine wurden konzentriert (11) und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt (Abb. (Abb.1).1). Vier Coomassie-gefärbte Proteinbanden, die differentiell exprimierten Proteinen entsprechen, wurden wie in einer früheren Studie (4) identifiziert und analysiert (Abb. (Abb.1).1). Die Häufigkeit von drei sekretierten Proteinen schien während des anaeroben Wachstums abzunehmen: das CbpD-Chitinbindungsprotein, LasB-Elastase und ein Protein unbekannter Funktion, das von PA0572 kodiert wurde. Frühere proteomische Studien fanden heraus, dass alle drei dieser Proteine Quorum-Sensing-induziert sind (11). Ein Protein schien während des anaeroben Wachstums im Überfluss erhöht zu sein und wurde entweder als flagellares Filamentprotein FliC oder als flagellares Deckprotein FliD identifiziert (aufgrund der Überlappung der Eigenschaften dieser beiden Proteine).

Die meisten äußeren Membranproteine von P. aeruginosa enthalten keine Cysteinreste und können daher nicht mit ICAT analysiert werden (4). Daher wurde die zweidimensionale (2D) SEITE als komplementäre Methode verwendet (4). Mehrere äußere Membranproteine (Abb. (Abb.2)2) wurden aus dem 2D-Gel herausgeschnitten und identifiziert (4). OprE schien während des anaeroben Wachstums an Häufigkeit zuzunehmen, während OprF und OprH an Häufigkeit zuzunehmen schienen (Abb. (Abb.2).2). Alle drei Proteine migrierten während der isoelektrischen Fokussierung als multiple Spezies (Abb. (Abb.2).2). Die verminderte Häufigkeit von OprF während des anaeroben Wachstums wurde durch Immunoblotting von äußeren Membranproteinen (Daten nicht gezeigt) unter Verwendung eines polyklonalen Anti-OprF-Antiserums (ein Geschenk von Robert Hancock, University of British Columbia in Vancouver, Kanada) bestätigt.

Unter den P. aeruginosa-Proteinen, die während des anaeroben Wachstums eine erhöhte Häufigkeit zeigten (Tabelle (Tabelle 1; 1; Abb. Abb.1),1), einige tragen zu Funktionen bei, die an der Bildung und Entwicklung von Biofilmen beteiligt sind. Zu diesen Proteinen gehören das Katabolit-Repressionskontrollprotein Crc und die zuckenden Motilitätsproteine PilU, PilG und ChpA (12, 13, 18). In Übereinstimmung mit einem erhöhten Crc-Spiegel in anaerob gewachsenen Zellen (Tabelle (Tabelle 1), 1) wurden bekannte Ziele der Crc-Repression in Hülle und Fülle verringert (Tabelle (Tabelle 2), 2), einschließlich der hmgA- und bkd-Genprodukte (6, 10). ChpA und PilG sind Bestandteile eines komplexen Regulierungssystems, das die Zuckungsmotilität steuert (18). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Expression oder Funktion von Zelloberflächenanhangsgebilden, die die Biofilmbildung beeinflussen, während des anaeroben Wachstums verändert wird. Solche Veränderungen können zu der erhöhten Biofilmbildung beitragen, die bei anaerob wachsendem P. aeruginosa beobachtet wird (20).

Zusätzlich zu den Veränderungen der äußeren Membranproteine, die während des anaeroben Wachstums beobachtet wurden, zeigte die ICAT-Analyse, dass mehrere Enzyme, die an der Biosynthese von P. aeruginosa lipopolysaccharid (LPS) beteiligt sind, während des anaeroben Wachstums in höheren Konzentrationen exprimiert wurden (Tabelle (Tabelle 1).1). Dazu gehörte ein Homolog der Beta-Hydroxylase LpxO2, die Lipid-A-Fettsäuren hydroxyliert (14); LPS-Kernheptosyltransferasen WaaC und WaaF (2, 15); und WbpG, das von einem Gencluster codiert wird, der an der Synthese eines langen B-Banden-O-Antigens beteiligt ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der LPS-Gehalt als Folge von Anaerobiose verändert werden könnte.

Zusammenfassend ändert sich das Proteom von P. aeruginosa während des anaeroben Wachstums signifikant. Wir identifizierten insgesamt 617 Proteine: 610 durch ICAT-Analyse, 4 durch SDS-PAGE-Analyse und 3 durch 2D-PAGE-Analyse. Von den 617 identifizierten Proteinen variierten die Häufigkeiten von 158 zwischen anaerob gewachsenen und aerob gewachsenen Zellen. Da P. aeruginosa unter unseren anaeroben Wachstumsbedingungen eine geringere Zelldichte erreichte als unter aeroben Wachstumsbedingungen, können dichteabhängige Veränderungen der Proteinexpression zu dem Proteom beigetragen haben, das wir während des anaeroben Wachstums nachgewiesen haben. Dennoch ist die Bakterienzelldichte in vielen Umweltnischen, in denen mehrere Nährstoffe (einschließlich Sauerstoff) knapp sind, wahrscheinlich ähnlich begrenzt. Daher tragen die festgestellten Veränderungen des Proteinspiegels zu einem Verständnis bei, wie das Proteom und der Stoffwechselzustand von Bakterien als Reaktion auf unterschiedliche Umgebungen variieren. Die direkte Analyse des bakteriellen Proteingehalts ist eine robuste Technologie zur Beobachtung der Anpassung von Bakterien an bestimmte Umweltnischen, einschließlich der oberen Atemwege.