Afinidad de hemoglobina por el oxígeno en tres subespecies de sapos (Bufo sp.) viviendo a diferentes altitudes
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 Clinicum Laboratorio Automatizado, Iquique, Chile
2 Laboratorio de Transporte de Oxígeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile
RESUMEN
Se midieron la afinidad por el oxígeno sanguíneo y las propiedades de los glóbulos rojos en tres subespecies del género Bufo: Bufo spinulosus limensis, recolectadas a nivel del mar y a una temperatura media diaria de 20ºC; Bufo spinulosus trifolium, desde 3100 m, temperatura media diaria de 15ºC; y Bufo spinulosus flavolineatus, desde 4100 m, temperatura media diaria de 10ºC. La electroforesis de la hemoglobina mostró el mismo componente en cada una de las tres subespecies. A 20ºC, las afinidades de oxígeno en sangre (P50) mostraron pequeñas diferencias entre Bufo spinulosus limensis y Bufo spinulosus trifolium, mientras que el valor para Bufo spinulosus flavolineatus fue notablemente inferior. A 10 ° C, la temperatura ambiente de Bufo spinulosus flavolineatus, el P50 fue extremadamente bajo en comparación con las otras dos subespecies a sus temperaturas ambiente correspondientes.
PALABRAS CLAVE: adaptaciones, altitud, anfibios, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, afinidad por la hemoglobina, hematocritos, unión al oxígeno, sapos
INTRODUCCIÓN
En Perú, el género Bufo ocupa un gradiente altitudinal que va desde el nivel del mar hasta más de 4000 m. La especie Bufo spinulosus tiene tres subespecies cuyos nichos se encuentran en altitudes bajas, intermedias y altas. Estas subespecies son Bufo spinulosus limensis (baja altitud), Bufo spinulosus trifolium (altitud intermedia) y Bufo spinulosus flavolineatus (gran altitud) (12). Una de las adaptaciones ambientales más estudiadas del sistema respiratorio en vertebrados es la de la hipoxia, que se produce de diversas maneras a gran altura, en el desarrollo embrionario (por ejemplo, en el útero) y en ambientes acuáticos, en particular de agua dulce. Estas adaptaciones comúnmente implican cambios en las propiedades de los glóbulos rojos, en la capacidad de transporte de oxígeno o en la afinidad de oxígeno de la hemoglobina. Las adaptaciones intraespecíficas, que ocurren en el mismo animal en condiciones diferentes, generalmente implican cambios en los factores alostéricos (es decir, las condiciones en las que la hemoglobina funciona dentro de los glóbulos rojos), mientras que las adaptaciones interespecíficas, que son evidentes al comparar diferentes especies, son atribuibles a cambios en las propiedades de las moléculas de hemoglobina.
La mayoría de los estudios sobre adaptaciones hipóxicas en las propiedades de los glóbulos rojos y la hemoglobina se refieren a peces y mamíferos, y se sabe muy poco sobre los vertebrados ectotérmicos inferiores. Un estudio anterior mostró que la rana del Lago Titicaca Telmatobius culeus (2) que vivía a 3800 m. tenía una afinidad de O2 en sangre más alta y células sanguíneas más pequeñas que las ranas a nivel del mar. Este estudio describe las adaptaciones en la subespecie Bufo.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se recolectaron anuros de la subespecie Bufo spinulosus limensis de las llanuras costeras a aproximadamente 400 km de nuestro laboratorio en Lima (nivel del mar, temperatura media diaria de 20ºC). Se recolectaron Bufo spinulosus trifolium en los Andes Centrales Peruanos (alrededor de 3100 m, temperatura media del día 15ºC), y Bufo spinulosus flavolineatus también en los Andes Centrales (a 4100 m, temperatura media del día 10ºC). Los animales fueron llevados a nuestro laboratorio en pocas horas. Se extrajo sangre en jeringas heparinizadas de los corazones de animales con médula anterior. Se pueden obtener aproximadamente 3 ml de sangre de Bufo spinulosus limensis y de 1 a 1,5 ml de la otra subespecie. La sangre de dos a tres animales se agrupó para llevar a cabo las determinaciones. Los recuentos de glóbulos rojos, la concentración de hemoglobina y los hematocritos se midieron mediante técnicas convencionales.
La electroforesis de la hemoglobina se realizó en tiras de acetato de celulosa en un tampón específico para electroforesis de hemoglobina, y las bandas se teñieron con Ponceau S y se leyeron en un densitómetro de acuerdo con el manual de instrucciones de Helena Laboratories (EE.
La afinidad sangre-oxígeno (P50) se midió mediante la técnica de mezcla (1,10) a 10ºC, 15ºC y 20ºC. El equilibrio de la sangre se llevó a cabo en un tonómetro mantenido a estas temperaturas utilizando mezclas de gases que contenían 4,5% de CO2 y concentraciones variables de O2 y N2. La saturación de O2 en sangre varió entre el 30 y el 80%. El medidor de pH se calibró con tampones de fosfato de alta precisión.
Los valores de pH a las temperaturas de equilibrio (eq) se calcularon a partir de los valores a las temperaturas de medición (meas) utilizando la ecuación dada por Rosenthal (8):
pHeq = pH meas + 0.0147 (Eqt _ Tmeas)
El factor Bohr se obtuvo cambiando el pH sanguíneo de la siguiente manera. El plasma preparado a partir de alícuotas sanguíneas se acidificó con ácido láctico o se alcalinizó con hidróxido de sodio y se reconstituyó con los glóbulos rojos correspondientes. Las muestras de sangre de Bufo spinulosus limensis y Bufo spinulosus trifolium se equilibraron a 20ºC y 15ºC y la sangre de Bufo spinulosus flavolineatus a 20ºC y 10ºC y a diferentes valores de pH para calcular el factor de Bohr para cada temperatura (14). Este factor permitió calcular el pH sanguíneo estándar a las tres temperaturas. Para calcular el coeficiente de Hill (n), se utilizó un método de aproximaciones sucesivas (10). Se calculó un valor de la ecuación de Bohr para cada subespecie a partir de datos en experimentos separados.
Se utilizó la ecuación de van’t Hoff para calcular el calor total de oxigenación DH’ a partir de los valores de P50. Para Bufo spinulosus limensis se utilizaron valores a 20ºC y 15ºC tomando 20ºC como temperatura ambiente. Para Bufo spinulosus trifolium se utilizaron los valores a 15ºC y 20ºC tomando como temperatura ambiente 15ºC. Para Bufo spinulosus flavolineatus se utilizaron los valores a 10ºC y 20ºC tomando 10ºC como temperatura ambiente. La significancia estadística fue determinada por la prueba t de Student con software Systat 6.0 para Windows.
RESULTADOS
Las tablas I y II resumen los datos hematológicos. No hay diferencia estadística entre los valores de Bufo spinulosus limensis y Bufo spinulosus trifolium. Los valores de hematocrito, hemoglobina y cantidad de glóbulos rojos en Bufo spinulosus flavolineatus son mucho más bajos.
Los experimentos de electroforesis mostraron las mismas distancias de migración en las hemoglobinas de cada una de las tres subespecies y la presencia de dos bandas en algunas de las corridas (Fig. 4). No se realizaron más estudios para definir las propiedades de la hemoglobina.
La Tabla II muestra las propiedades funcionales de la hemoglobina en sangre, revelando pequeñas diferencias en el P50 entre Bufo spinulosus limensis y Bufo spinulosus trifolium, mientras que el valor para Bufo spinulosus flavolineatus es menor. Los valores a la temperatura ambiente donde se recolectaron los animales no difirieron significativamente entre Bufo spinulosus limensis y Bufo spinulosus trifolium. En el caso de Bufo spinulosus flavolineatus, a 10ºC el valor de P50 es muy bajo. La Figura 1 muestra una gráfica de log P50 vs. pH. La Figura 2 muestra curvas de disociación de oxígeno de hemoglobina construidas con los valores de P50 y el coeficiente de Hill a 20º C. Las curvas para Bufo spinulosus limensis y Bufo spinulosus trifolium están muy próximas entre sí, mientras que la del Bufo spinulosus flavolineatus se desplaza hacia la izquierda. La Figura 3 es una gráfica del contenido de O2 en sangre frente a PO2 en sangre a la temperatura ambiente de cada subespecie. Esto muestra el bajo contenido de O2 y muy bajo P50 de Bufo spinulosus flavolineatus y un desplazamiento moderado a la izquierda de Bufo spinulosus trifolium en comparación con Bufo spinulosus limensis, sin reducción del contenido de O2 en sangre en Bufo spinulosus limensis y Bufo spinulosus trifolium.
Fig. 1: Efecto Bohr en tres subespecies de Bufo spinulosus. Bufo spinulosus flavolineatus muestra el mayor factor de Bohr.
Fig. 2: Curva de Disociación sanguínea para las tres subespecies a pH de 7,84 y 20º C. La curva del Bufo spinulosus flavolineatus está desplazada hacia la izquierda.
Fig. 3: Contenido de hemoglobina O2 vs presión parcial de oxígeno para cada subespecie a la temperatura ecológica respectiva. Bufo Spinulosus limensis (20º C), Bufo spinulosus trifolium (15º C)Bufo spinulosus flavolineatus (10º C). El contenido de hemoglobina de Bufo spinulosus flavolineatus es más bajo que en las otras dos subespecies y el P50 es muy bajo.
Fig. 4: Electroforesis de las tres subespecies de Bufo Spinulosus. El experimento muestra las mismas distancias de migración en las hemoglobinas de cada una de las tres subespecies y la presencia de dos bandas en algunas de las carreras.
Estos resultados muestran que a 20ºC Bufo spinulosus flavolineatus, cuyo hábitat natural es cercano a 4000 m y cuya temperatura ambiente promedia 10ºC, tiene un bajo contenido de hemoglobina y una alta afinidad de hemoglobina en comparación con Bufo spinulosus trifolium, cuya altitud ambiente promedio es cercana a 3000 m y cuya temperatura ambiente promedio es de 15ºC. Bufo spinulosus limensis (nivel del mar) y Bufo spinulosus trifolium tenían curvas casi idénticas. Si las curvas se obtuvieron a temperatura ambiente, el Bufo spinulosus flavolineatus mostró un contenido de O2 muy bajo y una afinidad de hemoglobina alta en comparación con las otras dos subespecies. En Bufo spinulosus flavolineatus, el alto DH ‘ indica una alta sensibilidad de la afinidad de la hemoglobina a los cambios en la temperatura ambiente, y el alto factor Bohr también indica una alta sensibilidad de la afinidad de la hemoglobina a los cambios en el pH de la sangre.
DISCUSIÓN
El género Bufo está muy extendido en los países andinos. Bufo spinulosus tiene tres subespecies cuyos nichos se encuentran en las laderas andinas inferiores, los valles intermedios (3000 m) y las llanuras más altas (por encima de 4000 m). La subespecie de altitud intermedia Bufo spinulosus trifolium y la subespecie a nivel del mar Bufo spinulosus limensis no difieren en sus valores hematológicos. El Bufo spinulosus flavolineatus de gran altitud tiene una concentración de hemoglobina mucho menor, pero las características de los glóbulos rojos son similares a las otras dos subespecies. Los glóbulos rojos parecen ser más pequeños que los de las otras dos subespecies, a diferencia de los hallazgos de Ruiz (9), que indicaron lo contrario. Se sabe que el género Bufo tiene una concentración de hemoglobina más alta que otros anfibios. Hutchinson y Szarki (3) atribuyen esto a la alta vascularización y hábito terrestre. Sin embargo, Bufo spinulosus flavolineatus tiene una concentración de hemoglobina muy baja.
En los tres grupos, el estudio electroforético de hemoglobina muestra individuos cuyo patrón electroforético presenta dos bandas de hemoglobina claramente separadas. No hay diferencia en la afinidad de hemoglobina entre Bufo spinulosus trifolium y Bufo spinulosus limensis a 20ºC, mientras que en Bufo spinulosus flavolineatus es mayor. Cuando se estudiaron las afinidades a la temperatura ambiente donde viven los animales, Bufo spinulosus trifolium tuvo curvas de disociación de oxígeno que se desplazaron moderadamente a la izquierda de Bufo spinulosus limensis, y Bufo spinulosus flavolineatus mostró un desplazamiento muy marcado, lo que indica una afinidad de hemoglobina muy alta.
Los mamíferos y aves nativos de gran altitud tienden a tener afinidades elevadas de oxígeno en la sangre y a no mostrar policitemia a gran altitud (5). Sería interesante observar si estas respuestas a la hipoxia ambiental y a las condiciones frías están presentes en animales ectotérmicos. En teoría, las condiciones de frío deberían ayudar a aumentar la tolerancia a la gran altitud, ya que disminuye la tasa metabólica. En el caso de Bufo spinulosus flavolineatus, cuya temperatura diurna bajo las rocas a 4100 m es de unos 10ºC y unos 6ºC o menos por la noche en los estanques donde descansan medio sumergidos, la alta afinidad indica presión de selección hacia hipoxia a pesar de una posible reducción de la tasa metabólica. Packard y Stiverson (7) no encontraron una relación entre la altitud y la concentración de hemoglobina en la rana coro (Pseudacris triseriata), pero el rango de altitud en su estudio (1500 m y 3000 m) fue pequeño.
La afinidad de la hemoglobina es una marca genética aparentemente seleccionada por el ambiente hipóxico en vertebrados. En mamíferos y aves, la afinidad es una propiedad bastante fija que no aumenta en la hipoxia y no desaparece en la normoxia (6). En los peces, por otro lado, el oxígeno en sangre aumenta notablemente bajo hipoxia (13).
Desde un punto de vista comparativo, hay algunas similitudes entre ectotermos y endotermos. Se ha encontrado que existe cierta correlación entre la afinidad de la hemoglobina y la altitud en subespecies de ratones que ocupan un gradiente altitudinal (11). También se ha demostrado que dentro de las mismas especies de mamíferos que viven a lo largo de un gradiente vertical en los Andes, los individuos que viven en el rango más alto tienen hemoglobinas con mayor afinidad que los individuos que viven en el rango más bajo. Estas diferencias fueron mayores en el caso del zorro andino, donde dos especies separadas ocupan los dos extremos del rango de altitud (4).
Este trabajo refuerza el concepto de que la policitemia no es seleccionada como parámetro adaptativo al ambiente hipóxico. Por el contrario, la hemoglobina de alta afinidad parece estar fuertemente seleccionada en una variedad de animales que viven a gran altitud.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos al Dr. Roy E. Weber su ayuda para aclarar nuestro pensamiento sobre este tema y para revisar el manuscrito.
Autor para correspondencia: Hrvoj Ostojic P.-Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chile. Teléfono: (56-57) 420599, Fax: (56-57) 427683, correo electrónico: [email protected]
Recibido: 13 de agosto de 1999. Aceptado en forma revisada: 6 de mayo de 2000
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