La distribución de Poisson, nombrada en honor al matemático francés Siméon Denis Poisson, es la probabilidad de ocurrencia de un número dado de eventos en un período de tiempo dado (fijo) si los eventos ocurren a una velocidad constante (conocida) y son independientes de la ocurrencia del evento anterior. Se basa en una distribución de probabilidad discreta, donde el conjunto de resultados es discreto o finito, como el lanzamiento de una moneda o el lanzamiento de dados.
En el contexto de un experimento de PCR digital, los resultados discretos son la presencia o ausencia del gen diana. Se espera que las miles de particiones individuales producidas para una reacción de PCR digital sigan una distribución de Poisson, teniendo en cuenta que las particiones están monodispersas y contienen el volumen equivalente de la mezcla de muestras.
Si no se cumplen estos parámetros y las particiones exhiben polidispersidad, el volumen de mezcla de muestras en las particiones variará en gran medida y las particiones más grandes pueden contener más objetivos que las más pequeñas, lo que reduce la precisión de la reacción de PCR digital.
En este artículo, le guiamos a través del cálculo matemático de la Ley de Poisson para un experimento de PCR digital.
Para un experimento de PCR digital, un pozo que contenga la muestra de interés dividida y un gen objetivo para cuantificar, primero necesitamos definir las siguientes variables:
- \(N\): número total de particiones analizables en el pozo
- \(p\): número de particiones positivas para el gen objetivo
- \(v\): volumen de la partición (en µL), que se supone constante
- \(d\): factor de dilución utilizado para diluir la muestra de la reserva al pozo
(por ejemplo, \(d = 10\) significa que la muestra se ha diluido 10 veces)
y luego estas muestras adicionales:
-
\(V = N \ v\): volumen total de partición inyectado en el pozo
-
\(C_{0}\) : concentración de genes diana en el pozo (en copias / µL)
-
\(C = d \ C_{0}\): concentración de genes diana en el stock (en copias / µL)
-
\(\lambda = C_{0} \ v\): número medio de genes diana por partición en el pozo
La distribución de los genes diana encapsulados en las particiones del pozo sigue una distribución de Poisson del parámetro \(\lambda\):
Proba ( la partición encapsula \(\text {k k}}\) genes diana) \ (=\dfrac{\lambda^k} {k!} e^{- \lambda}\)
Se dice una partición:
-
«Partición positiva» si ha encapsulado al menos 1 gen objetivo (en cuyo caso observaremos una partición fluorescente en el punto final del proceso de amplificación, por lo que la mayor parte de la incertidumbre radica en esta condición de» al menos una»)
-
» Partición negativa » si ha encapsulado el gen objetivo 0 (en cuyo caso observaremos una partición no fluorescente en el punto final del proceso de amplificación)
La distribución de particiones positivas en el pozo sigue una distribución binomial de probabilidad \(1 – e^{-\lambda}\):
- Probabilidad (bien contiene \(\text{$p$}\) positivo particiones \(= {\rm C}_{N}^{p} (1 – e^{-\lambda})^p (e^{-\lambda} )^{N-p} \)
- Probabilidad (partición es negativo) \( = e^{-\lambda} \)
- Probabilidad (partición es positivo) \( = 1 – e^{-\lambda} \)
Si \(N\) es lo suficientemente grande:
- Proba (partición es positivo) \(= \dfrac{p}{N} \)
Por tanto, la fórmula para la estimación del stock de concentración es:
\ (C – – \dfrac{d} {v} \ ln {\left(1 – \dfrac{p} {N} \ right)} \)
Si necesita calcular automáticamente las concentraciones estimadas de genes diana, junto con su intervalo de confianza y su incertidumbre relativa, hay disponible una herramienta en línea: Ley de Poisson: Yendo más allá. ¡Inténtalo!
Para obtener más información sobre las curvas de incertidumbre, así como los límites de detección y cuantificación, consulte el artículo: Rangos dinámicos de detección & Cuantificación.