Informes oncológicos

Introducción

El cáncer de pulmón es un tumor maligno con la mayor morbilidad y mortalidad a nivel mundial, y su incidencia va en aumento. Aproximadamente el 80% de la enfermedad se puede atribuir al cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCNP) (1). Debido a las limitaciones de las técnicas de diagnóstico precoz y a la falta de manifestaciones clínicas específicas tempranas, el 70-80% de los pacientes se diagnostican en estadios avanzados(2). Por lo tanto, la identificación de un tratamiento farmacológico seguro y eficaz para el CPCNP es crucial.

Los hallazgos recientes han demostrado que la incidencia,el desarrollo y la transferencia de CPCNP no solo están influenciados por factores genéticos, sino que el cambio epigenético también es importante,incluido el ARN no codificador de moléculas pequeñas (ncRNA) (3). El microRNA (miARN), una clase de endogeniosncrna pequeño con una longitud de ~21-25 bases, ineukaryotes ampliamente existentes, puede identificar el ARNm de un gen diana específico(4). Más de 50% de los genomas de miRNAs se mapean en sitios frágiles o regiones genómicas relacionados con el CPCNP,lo que indica que la expresión de miRNA puede estar estrechamente relacionada con el CPCNP. Como se informó, la expresión de un gran número de miRNAs en el CPCNP muestran trastorno y el desequilibrio de miRNAs promueven la progresión del ciclo celular del CPCNP, el efecto antiapoptótico, la invasión celular reforzada y la metástasis del cáncer de pulmón de células no pequeñas(5).

La vía de señalización PI3K/Akt desempeña un papel importante en la supervivencia celular mediada por factores de crecimiento. Hallazgos previos han demostrado que el trastorno de la vía PI3K/Akt/mTOR puede desempeñar un papel importante en la formación de CPCNP (6). También se ha informado de que la señal de proliferación celular generada por la combinación de un número de receptores de transmembrana y ligandos puede activar la transferencia de señales de PI3K/Akt/mTOR, que está estrechamente asociada con la proliferación y el estado de supervivencia del CPNN (7). Estos receptores incluyen el c-met, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el c-kit y el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR).

La curcumina es un ingrediente activo natural extraído del rizoma seco del género de cúrcuma, cúrcuma y cúrcuma, con amplios efectos farmacológicos, baja toxicidad y buena tolerancia, y debido a su valor económico, se ha convertido en un punto de acceso para la exploración (8). Los hallazgos de estudios centrados en la curcumina han identificado una amplia gama de actividades farmacológicas,como antiinflamatorias, antioxidantes, lipídicas, antivirales, antiinfecciones,anticancerígenas, anticoagulantes, antifibrosis hepática y aterosclerosis, baja toxicidad y pocos efectos secundarios (9-13).Sin embargo, el efecto de la curcumina sobre el CPCNP y el mecanismo molecular subyacente sigue sin estar claro. En el presente estudio, analizamos el efecto anticancerígeno de la curcumina sobre la proliferación celular y la apoptosis del CPCNP humano e identificamos una posible relación entre este efecto y la vía de señalización PI3K/Akt modulada por miRNA-192-5p.

Materiales y métodos

Productos químicos

El medio de aguila modificado de Dulbecco (DMEM) y el suero fetalcalf (FBS) se compraron a Gibco (Carlsbad, CA, EE. El bromuro de 3-(4,5-Dimetil-tiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio(MTT) se compró a Sangon Biotech (Shanghai, China). El kit de detección de Apoptosis I se compró en Bd Biosciences (San José, CA, EE. UU.). El kit de análisis de actividad caspase-3 se compró a Promega (Madison, WI, EE.UU.).

Cultivo celular

Células epiteliales pulmonares NCL-H460 y BEAS-2E normales humanas, y células cancerosas pulmonares humanas A549 se obtuvieron del Centro de Recursos Celulares de la Segunda Universidad Médica Militar. Estas células se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS (ambos de Gibco), 100 U/ml de penicilina y 100 µg / ml de estreptomicina a 37°C y una incubadora humidificada con 5% de CO2. Se examinaron las concentraciones (5,10,20 y 40 µM) y los períodos de tiempo (12 y 24 h) de curcumina frente a células A549. La estructura química de la curcumina se muestra en la Fig.1.

Análisis de viabilidad celular

Las células se sembraron a una densidad de 5×103/pocillo en placas de 96 pocillos. En resumen, la viabilidadde las células se midió mediante el ensayo MTT (Sangon Biotech). Se agregaron diez microlitros MTT (5 mg/l) en cada pozo y se incubaron durante 4 h a 37°C en incubadora ahumidificada con 5% de CO2. Sulfóxido de dimetilo (150 µl; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) se añadieron a cada pozo y se agitaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia se midió a 450 nM utilizando un lector de placa amic.

Anexina V-FITC/yoduro de propidio (PI)análisis de apoptosis

Se sembraron células a una densidad de 1×106/pocillo en placas de 6 pocillos. Las células cultivadas se lavaron dos veces con PBS helado y luego se teñieron con Anexina V-FITC y se utilizó el kit de detección de apoptosis I de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Biosciences). La apoptosis se analizó mediante citometría de flujo utilizando el software CellQuest Pro (IVD) (ambos de BDBiociencias).

Análisis de activación de Caspasa-3

Se sembraron células a una densidad de 5×103/pocillo en placas de 96 pocillos. La actividad de caspasa-3 se midió utilizando un kit de ensayo de actividad de caspasa-3 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). Cien microlitros de tampón de reacción con sustrato de 10 µl Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroanilina (pNA) se añadieron al lisado de células proteicas de 10 µl/pocillo y se incubaron a 37°C durante 6 h. La actividad de la caspasa-3 se analizó a una absorbancia de 405 nm.

Transfección celular

Los medicamentos miR-192-5p, anti-miR-192-5p y de control negativo (miR-NC) se compraron a Sangon Biotech. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y crecieron hasta un 50-60% de confluencia previa a la transfección. Las imitaciones se transfectaron con Lipofectamina2000 a células de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Invitrogen Life Technologies). Se aislaron 24 transfecciones de genes o proteínas y se utilizaron para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) o análisis de western blot,respectivamente.

RT-qPCR

Se sembraron células a una densidad de 5×103/pocillo en placas de 96 pocillos. El ARN total se extrajo de las células utilizando reactivo TRIzol (Invitrogen Life Technologies).La concentración de ARN se determinó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ® ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, USA). La cuantificación de los miRNAs se realizó mediante un kit de ensayo de miRNA TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). El ARN total se sometió a síntesis de ADNc de primera hebra y se examinó utilizando un kit de reactivos PrimeScript RT (ambos de Takara,Shiga, Japón). El qPCR se realizó utilizando SYBR – Green PCR Master Mix (Takara) en el sistema ABI 7500HT. Los cebadores utilizados en las acciones se muestran en el cuadro I.

Cuadro I Los cebadores PCR utilizados en las acciones.

Análisis de Western blot

Se sembraron células a una densidad de 5×103 / pocillo en placas de 96 pocillos. Las células cultivadas se lavaron dos veces con PBS heladas y se incubaron con tampón de lisis helada durante 30 min en hielo. El líquido celular se recogió y centrifugó a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 ° C. La concentración de proteínas solubles se determinó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Sigma, St.Louis, MO,EE. UU.). Las proteínas totales (10 µg) se ejecutaron con geles de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio (SDS) al 12% y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon con solución salina tamponada con inhibidores (TBS, por sus siglas en inglés) que contenía un 5% de leche descremada hasta bloquear sitios de unión no específicos. Las membranas se incubaron con anti-PI3K (1:1,500) y anti-Akt (1:1000) (ambos de Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EE. UU.) y anti-β-actina (1:500;Sangon Biotech) durante la noche a 4°C. Después de lavarse con un 1% de Tween-20 / PBS, las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios (Tiangen, Beijing, China) durante 2 h a temperatura ambiente.Las proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Vilber, Marne La Vallée, Francia).

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS 19.0. Los resultados se presentan como media ± DE. Los resultados se analizaron utilizando la prueba t de Student o el análisis de varianza unidireccional(ANOVA). P< 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

Resultados

La curcumina inhibe la viabilidad de las células A549

Las concentraciones (5, 10, 20 y 40 µM) y los períodos de tiempo (12, 24 o 36 h) de curcumina frente a las células A549 se evaluaron utilizando el ensayo MTT. Higo.2 muestra que el tratamiento de células A549 para 12, 24 o 48 h con curcumina de 10, 20 y 40 µM inhibió la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis y del tiempo. El ensayo MTT indicó que el tratamiento con cúrcuma (20 y 40 µM) durante 24 o 36 h resultó en una viabilidad celular insignificante, en comparación con el grupo control(Fig. 2).

La curcumina induce la apoptosis de células A549

Antes del tratamiento, también se midió la tasa apoptótica de células A549 tratadas con curcumina (10, 20 o 40 µM). Tras el tratamiento con curcumina de 20 ó 40 µM durante 24 h, la tasa de apoptosis aumentó notablemente en un escáner dependiente de la dosis, en comparación con el grupo control (Fig. 3).

La curcumina induce la actividad de caspasa-3 de las células a549

Para determinar si la curcumina induce la actividad de caspasa-3 de las células A549, la actividad de caspasa-3 se midió utilizando un kit de ensayo de actividad de acaspasa-3. La actividad de la caspasa – 3 también aumentó significativamente de manera dependiente de la dosis después del tratamiento con curcumina (20 o 40 µm) durante 24 h, en comparación con el grupo control(Fig. 4). Estos resultados indicaron que la curcumina indujo apoptosis en las células A549.

miR-192-5p inhibe la viabilidad celular e induce la apoptosis de las células A549

Para examinar la expresión y el significado de MIR-192-5p en células epiteliales pulmonares normales humanas y células cancerosas pulmonares,se detectó la expresión relativa de miR-192-5p mediante RT-qPCR.Higo. 5A muestra que la expresión preliminar de miR-192-5 de las células NCL-H460 fue relativamente menor, la de las células a549 fue mayor, siendo las células BEAS-2E las más altamente expresadas.

Para analizar si miR-192-5p influyó en la viabilidad celular y la apoptosis de las células A549, transfectamos MIR-192-5pmímicos a células A549. Las células transfectadas con MIR-192-5pmimics mostraron un aumento significativo de 120 veces en la expresión de miR-192-5p después de 48 h de transfección, en comparación con el grupo controlmiRir-NC (Fig. 5B).La sobreexpresión de miR-192-5p disminuyó la viabilidad de las células A549,en comparación con el grupo control o el grupo miR-NC (Fig. 5C). Sin embargo, la sobreexpresión de MIR-192-5p indujo la tasa apoptótica de las células A549, en comparación con el grupo control o el grupo miR-NC (Fig.5D).

La inhibición de miR-192-5p suprime la viabilidad celular e induce la apoptosis de las células A549

Para determinar si el anti-miR-192-5p influyó en la viabilidad celular y la apoptosis de las células A549, transfectamos el anti-miR-192-5p a las células A549. El nivel de expresión de MIR-192-5p se detectó mediante RT-qPCR después de 48 h de transfección.Los imitaciones Anti-miR-192-5p suprimieron efectivamente la expresión preliminar de miR-192-5 de las células A549 (Fig.6A). La regulación a la baja de miR-192-5p promovió la viabilidad celular e inhibió la tasa apoptótica de las células A549, respectivamente, en comparación con el grupo control o el grupo miR-NC (Fig.6B y C).

La curcumina inhibe la expresión del gen miR-192-5p de las células A549

Para determinar si la curcumina influyó en la expresión del gen Mir-192-5p de las células A549, se detectó el nivel de expresión de miR-192-5p mediante RT-qPCR después del tratamiento con curcumina durante 24 horas. Fig. 7 muestra que el nivel de expresión de miR-192-5p fue notablemente mejorado por la curcumina (20 o 40 µm).

miR-192-5p inhibe el efecto de la curcumina sobre la viabilidad celular e induce la apoptosis de las células A549

Para examinar cómo la sobreexpresión de miR-192-5p influyó en el efecto de la curcumina sobre la viabilidad celular y la tasa apoptótica de las células A549, transfectamos miR-192-5p imita a las células Aa549. Higo. 8 muestra que la curcumina suprimió la viabilidad celular y aumentó la tasa apoptótica de las células A549 después del tratamiento con curcumina (20 µM) durante 24 h, respectivamente, en comparación con el grupo de control. El efecto de la curcumina (20 µM) sobre la viabilidad celular y la tasa apoptótica de las células a549 disminuyeron notablemente y aumentaron con MIR-192-5pmimics, respectivamente, en comparación con el grupo tratado con curcumina(Fig. 8A).

La inhibición de miR-192-5p suprime el efecto de la curcumina sobre la viabilidad celular e induce la apoptosis de células A549

Para examinar cómo la regulación a la baja de miR-192-5p influyó en el efecto de la curcumina sobre la viabilidad celular y la tasa apoptótica de las células A549, transfectamos anti-miR-192-5p a las células A549 . Higo. 9 muestra que la curcumina suprimió la viabilidad celular y aumentó la tasa apoptótica de las células A549 después del tratamiento con curcumina (20 µM) durante 24 h, respectivamente, en comparación con el grupo de control. Sin embargo, el efecto de la curcumina (20 µM) sobre la viabilidad celular y la tasa apoptótica de las células A549 se incrementaron y redujeron marcadamente por imitaciones de anti-miR-192-5p, respectivamente, en comparación con el grupo tratado con la curcumina (Fig.9A).

La curcumina inhibe la expresión de la proteína PI3K / Akt de las células A549

Para determinar si la curcumina afectó la expresión de la proteína PI3K/Akt de las células A549, la expresión de la proteína PI3K/Akt se detectó mediante el análisis de western blot después del tratamiento con curcumina durante 24 h. Fig. 10 muestra que la expresión de la proteína PI3K/Akt fue notablemente mejorada por la vitamina C (20 o 40 µM).

miR-192-5p se dirige directamente a las células PI3K/Akt ofA549

Para examinar cómo la sobreexpresión de miR-192-5p influyó en la expresión de proteínas PI3K/Akt de las células A549, la MIR-192-5p wetransfectada se imita en las células A549. Higo. 11A y B muestran que la curcumina comprimió las expresiones proteicas PI3K / Akt de las células A549 tras el tratamiento con curcumina (20 µM) durante 24 h, en comparación con el grupo de control. El efecto de la curcumina (20 µM) sobre la expresión proteica Pi3k/Akt de las células A549 fue evidentemente reducido por imitaciones de MIR-192-5p, en comparación con el grupo tratado con curcumina(Fig. 11C y D).

La inhibición de miR-192-5p aumenta la expresión de Pi3k/Akt de las células A549

Para determinar si el anti-miR-192-5p influyó en el efecto de la curcumina sobre la expresión de la proteína PI3K/Akt de las células A549, el anti-miR-192-5p wetransfectado imita en las células A549. Higo. 12A y B muestran que la curcumina comprimió la expresión proteica PI3K/Akt de las células A549 tras el tratamiento con curcumina (20 µM) durante 24 h, respectivamente,en comparación con el grupo control. Sin embargo, el efecto de la curcumina(20 µM) sobre la expresión de la proteína PI3K/Akt de las células A549 fue notablemente mejorado por imitaciones anti-miR-192-5p, respectivamente, comparadas con el grupo tratado con curcumina (Fig.12C y D).

Discusión

Un millón de pacientes sucumben al CPCNP anualmente en todo el mundo, y la incidencia de CPCNP está aumentando gradualmente.Aunque en los últimos años una serie de estudios se han centrado en el CPCNP, no se ha avanzado mucho con respecto al tratamiento. La cirugía sigue siendo el método de tratamiento más eficaz, pero en términos de prevención, así como para la patogénesis del CPCNP, es necesario realizar estudios adicionales (14,15). Recientemente, Liu et al identificaron que la curcumina inhibe la proliferación e induce significativamente la tasa apoptótica de células cancerosas gástricas (16). Ma et al demostraron que la curcumina inhibe el crecimiento celular y la invasión de células cancerosas pancreáticas (17). Colectivamente, nuestros hallazgos indicaron que la curcumina suprimió la viabilidad celular, indujo la apoptosis celular y aumentó la actividad de la caspasa-3 de las células A549.Por lo tanto, la curcumina es un medicamento potencial para la oncoterapia.

El miARN es una clase de ARN de molécula pequeña que tiene un papel muy importante en la regulación de la expresión génica, identificado recientemente (18). Los genes de miARN se localizan habitualmente en segmentos intrónicos del gen. Sin embargo, los miRNAs también se distribuyen fuera de los exones no codificantes del gen y de la región intergénica, que se ha encontrado que participan en una variedad de vías ogénicas onc conocidas, como p53, Bcl-2 y K-Ras(19). Se ha demostrado que> 50% de los miRNAs humanos definidos se encuentran en los sitios frágiles del genoma y que estos sitios frágiles a menudo se asocian con la aparición de CPNM (20). Los perfiles de expresión de los miRNAs están asociados con el desarrollo de CPNM. miR-34c, miR-145 y miR-142 pueden inhibir el CPNM (5). Los resultados del presente estudio indican que la expresión relativa miR-192-5p de las células NCL-H460 fue relativamente baja, la de las células A549 fue mayor, siendo las células BEAS-2E las más altamente expresadas. La sobreexpresión de miR-192-5pd redujo la viabilidad celular y aumentó la tasa apoptótica de las células a549. La regulación a la baja de miR-192-5p aumentó la viabilidad celular y redujo la tasa apoptótica de las células A549.Además, la curcumina inhibió la expresión génica de MIR-192-5p de células A549. Sin embargo, la regulación al alza de la expresión de miR-192-5p mejoró el efecto de la curcumina en la viabilidad celular y la tasa apoptótica de las células A549, mientras que la regulación a la baja de la expresión de miR-192-5p revirtió el efecto de la curcumina en las células A549. Nuestros resultados fueron coherentes con los de otros estudios. Por ejemplo, Ye etal informó que la curcumina promueve la apoptosis celular activando Mir-192-5p (21). Sin embargo, los mecanismos probables sobre cómo la curcumina influye en la expresión de miR-192-5 no están claros y se deben realizar estudios futuros para determinar este efecto.

En los últimos años, el efecto de la vía de señalización PI3K/Akt en el CPNM humano ha ganado mucha atención (22). La activación de la vía de señalización PI3K/Akt es muy común en el CPCNP humano, que puede promover la aparición de cáncer a través de una variedad de mecanismos, que incluyen mutaciones génicas, reducción de la presión ptenexpresora del gen supresor del cáncer, mutación o amplificación de PI3K, mutación o amplificación de Akt y activación de receptores oncogénicos (7). La activación de cada componente de esta vía es la razón principal del pronóstico desfavorable del CPCNP,que puede conducir a la resistencia a los medicamentos del tratamiento, por lo que la inhibición de esta vía puede revertir la resistencia a los medicamentos y mejorar los efectos de la quimioterapia y la radiación in vivo (23). Los datos obtenidos en el presente estudio revelaron que la curcumina suprimía la expresión de la proteína PI3K/Akt de las células A549. La regulación ascendente de la expresión miR-192-5p restringió la expresión proteica PI3K/Akt de las células A549.La regulación a la baja de la expresión de miR-192-5p puede aumentar la expresión de la proteína PI3K/Akt de las células A549. Xu et al han demostrado que la curcumina inhibe la invasión y migración de las células FTC133 mediante la regulación a la baja de la vía de señalización PI3K/Akt en células tiroideas cancerígenas (24). Xu y otros sugirieron que la curcumina inhibe la proliferación tumoral del cáncer de pulmón a través de la vía PI3K/Akt (25).Schee et al revelaron que miR-22-3p, miR-143-3p y MIR-192-5p regulaban y participaban en APC, TGFß y PI3Kpathway en células de cáncer colorrectal (26).

En conclusión, este estudio se centró en el efecto de la cúrcuma contra las células A549, inhibió la proliferación celular e indujo la apoptosis del CPNM humano a través de la regulación ascendente de MIR-192-5p y la supresión de la vía de señalización PI3K/Akt. Las conclusiones del presente estudio indican que la curcumina es un blanco potencial en el tratamiento del CPCNP. Sin embargo, el presente estudio reveló algunas limitaciones, ya que no examinamos la relación detallada entre miR-192-5p y la vía PI3K/Akt en células de cáncer de pulmón. Estudios adicionales in vivo, clínicos y a mayor escala, se realizarán análisis estadísticos del presente estudio para verificar los resultados.