Affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène chez trois sous-espèces de crapauds (Bufo sp.) vivant à différentes altitudes
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 Clinicum Laboratorio Automatizado, Iquique, Chili
2 Laboratorio de Transporte de Oxígeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Pérou
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Chili
RÉSUMÉ
L’affinité de l’oxygène dans le sang et les propriétés des globules rouges ont été mesurées chez trois sous-espèces du genre Bufo : Bufo spinulosus limensis, recueillies au niveau de la mer et à une température moyenne de 20ºC par jour; Bufo spinulosus trifolium, à partir de 3100 m, température moyenne journalière de 15ºC; et Bufo spinulosus flavolineatus, à partir de 4100 m, température moyenne journalière de 10ºC. L’électrophorèse de l’hémoglobine a montré le même composant dans chacune des trois sous-espèces. À 20ºC, les affinités de l’oxygène dans le sang (P50) montraient de petites différences entre Bufo spinulosus limensis et Bufo spinulosus trifolium, alors que la valeur pour Bufo spinulosus flavolineatus était nettement plus faible. À 10ºC, la température ambiante de Bufo spinulosus flavolineatus, la P50 était extrêmement basse par rapport aux deux autres sous-espèces à leurs températures ambiantes correspondantes.
MOTS CLÉS: adaptations, altitude, amphibiens, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, affinité de l’hémoglobine, hématocrites, liaison à l’oxygène, crapauds
INTRODUCTION
Au Pérou, le genre Bufo occupe un gradient altitudinal allant du niveau de la mer à plus de 4000 m. L’espèce Bufo spinulosus a trois sous-espèces dont les niches sont à basse, moyenne et haute altitude. Ces sous-espèces sont Bufo spinulosus limensis (basse altitude), Bufo spinulosus trifolium (altitude intermédiaire) et Bufo spinulosus flavolineatus (haute altitude) (12). L’une des adaptations environnementales les plus étudiées du système respiratoire chez les vertébrés est celle de l’hypoxie, qui survient diversement à haute altitude, dans le développement embryonnaire (par exemple in utero) et dans des environnements aquatiques, en particulier en eau douce. Ces adaptations impliquent généralement des modifications des propriétés des globules rouges, de la capacité de transport de l’oxygène ou de l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène. Les adaptations intraspécifiques, qui se produisent chez le même animal dans des conditions différentes, impliquent généralement des modifications des facteurs allostériques (c’est-à-dire les conditions dans lesquelles l’hémoglobine fonctionne à l’intérieur des globules rouges), tandis que les adaptations interspécifiques, évidentes lors de la comparaison de différentes espèces, sont attribuables à des modifications des propriétés des molécules d’hémoglobine.
La plupart des études sur les adaptations hypoxiques des propriétés des globules rouges et de l’hémoglobine se réfèrent aux poissons et aux mammifères, et on en sait très peu sur les vertébrés ectothermiques inférieurs. Une étude antérieure a montré que la grenouille du lac Titicaca Telmatobius culeus (2) vivant à 3800 m. avait une affinité sanguine en O2 plus élevée et des cellules sanguines plus petites que les grenouilles du niveau de la mer. Cette étude décrit les adaptations chez la sous-espèce Bufo.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Des anoures de la sous-espèce Bufo spinulosus limensis ont été collectés dans les plaines côtières à environ 400 km de notre laboratoire de Lima (niveau de la mer, température moyenne journalière de 20ºC). Les Bufo spinulosus trifolium ont été collectés dans les Andes centrales du Pérou (environ 3100 m, température moyenne journalière de 15ºC), et Bufo spinulosus flavolineatus également dans les Andes centrales (à 4100 m, température moyenne journalière de 10ºC). Les animaux ont été amenés à notre laboratoire en quelques heures. Du sang a été prélevé dans des seringues héparinées dans le cœur d’animaux préalablement rongés. Environ 3 ml de sang ont pu être obtenus de Bufo spinulosus limensis et 1 à 1,5 ml des autres sous-espèces. Le sang de deux à trois animaux a été mis en commun afin de procéder aux déterminations. Le nombre de globules rouges, la concentration en hémoglobine et les hématocrites ont été mesurés par des techniques conventionnelles.
L’électrophorèse de l’hémoglobine a été effectuée sur des bandes d’acétate de cellulose dans un tampon spécifique pour l’électrophorèse de l’hémoglobine, et les bandes ont été colorées au Ponceau et lues dans un densitomètre selon le manuel d’instructions des Helena Laboratories (USA).
L’affinité sang-oxygène (P50) a été mesurée par la technique de mélange (1,10) à 10ºC, 15ºC et 20ºC. L’équilibration sanguine a été réalisée dans un tonomètre maintenu à ces températures en utilisant des mélanges gazeux contenant 4,5% de CO2 et des concentrations variables en O2 et N2. La saturation en O2 dans le sang variait entre 30 et 80 %. Le pH-mètre a été étalonné à l’aide de tampons phosphatés de haute précision.
Les valeurs de pH aux températures d’équilibre (eq) ont été calculées à partir de celles aux températures de mesure (meas) en utilisant l’équation donnée par Rosenthal (8):
pHeq = pH meas + 0,0147 (Teq _ Tmeas)
Le facteur de Bohr a été obtenu en modifiant le pH sanguin comme suit. Le plasma préparé à partir d’aliquotes de sang a été soit acidifié avec de l’acide lactique, soit alcalinisé avec de la soude et reconstitué avec les globules rouges correspondants. Les échantillons de sang de Bufo spinulosus limensis et de Bufo spinulosus trifolium ont été équilibrés à 20ºC et 15ºC et le sang de Bufo spinulosus flavolineatus à 20ºC et 10ºC et à différentes valeurs de pH afin de calculer le facteur de Bohr pour chaque température (14). Ce facteur a permis le calcul du pH sanguin standard aux trois températures. Pour calculer le coefficient de Hill (n), une méthode d’approximations successives a été utilisée (10). Une valeur de l’équation de Bohr pour chaque sous-espèce a été calculée à partir des données d’expériences distinctes.
L’équation de van’t Hoff a été utilisée pour calculer la chaleur globale d’oxygénation DH’ à partir des valeurs P50. Pour le Bufo spinulosus limensis, des valeurs à 20ºC et 15ºC ont été utilisées en prenant 20ºC comme température ambiante. Pour le Bufo spinulosus trifolium, les valeurs à 15ºC et 20ºC ont été utilisées en prenant 15ºC comme température ambiante. Pour le Bufo spinulosus flavolineatus, les valeurs à 10ºC et 20ºC ont été utilisées en prenant 10ºC comme température ambiante. La signification statistique a été déterminée par le test t de Student avec le logiciel Systat 6.0 pour Windows.
RÉSULTATS
Les tableaux I et II résument les données hématologiques. Il n’y a pas de différence statistique entre les valeurs de Bufo spinulosus limensis et de Bufo spinulosus trifolium. Les valeurs de l’hématocrite, de l’hémoglobine et de la quantité de RBC dans Bufo spinulosus flavolineatus sont beaucoup plus faibles.
Les expériences d’électrophorèse ont montré les mêmes distances de migration dans les hémoglobines de chacune des trois sous-espèces et la présence de deux bandes dans certaines des pistes (Fig. 4). Aucune autre étude n’a été réalisée pour définir les propriétés de l’hémoglobine.
Le tableau II montre les propriétés fonctionnelles de l’hémoglobine dans le sang, révélant de petites différences dans la P50 entre Bufo spinulosus limensis et Bufo spinulosus trifolium, alors que la valeur pour Bufo spinulosus flavolineatus est plus faible. Les valeurs à la température ambiante où les animaux ont été recueillis ne différaient pas significativement entre Bufo spinulosus limensis et Bufo spinulosus trifolium. Dans le cas de Bufo spinulosus flavolineatus, à 10ºC, la valeur P50 est très faible. La figure 1 montre un graphique du log P50 par rapport au pH. La figure 2 montre des courbes de dissociation de l’hémoglobine et de l’oxygène construites avec les valeurs de P50 et du coefficient de Hill à 20º C. Les courbes de Bufo spinulosus limensis et de Bufo spinulosus trifolium sont très proches l’une de l’autre, tandis que celle de Bufo spinulosus flavolineatus est décalée vers la gauche. La figure 3 est un graphique de la teneur en O2 du sang par rapport au PO2 du sang à la température ambiante de chaque sous-espèce. Ceci montre la faible teneur en O2 et la très faible P50 de Bufo spinulosus flavolineatus et un déplacement modéré vers la gauche de Bufo spinulosus trifolium par rapport à Bufo spinulosus limensis sans réduction de la teneur en O2 dans le sang chez Bufo spinulosus limensis et Bufo spinulosus trifolium.
Fig. 1 : Effet Bohr chez trois sous-espèces de Bufo spinulosus. Le Bufo spinulosus flavolineatus présente le plus grand facteur de Bohr.
Fig. 2 : Courbe des dissociations sanguines pour les trois sous-espèces à pH de 7,84 et 20º C. La courbe du Bufo spinulosus flavolineatus est déplacée vers la gauche.
Fig. 3: Teneur en hémoglobine O2 vs pression partielle d’oxygène pour chaque sous-espèce à la température écologique respective. Bufo Spinulosus limensis (20º C), Bufo spinulosus trifolium (15º C) Bufo spinulosus flavolineatus (10º C). La teneur en hémoglobine de Bufo spinulosus flavolineatus est inférieure à celle des deux autres sous-espèces et la P50 est très faible.
Fig. 4 : Électrophorèse des trois sous-espèces de Bufo Spinulosus. L’expérience montre les mêmes distances de migration dans les hémoglobines de chacune des trois sous-espèces et la présence de deux bandes dans certaines des pistes.
Ces résultats montrent qu’à 20ºC Bufo spinulosus flavolineatus, dont l’habitat naturel est proche de 4000 m et dont la température ambiante moyenne est de 10ºC, présente une faible teneur en hémoglobine et une affinité élevée pour l’hémoglobine par rapport à Bufo spinulosus trifolium, dont l’altitude ambiante moyenne est proche de 3000 m et dont la température moyenne ambiante est de 15ºC. Bufo spinulosus limensis (niveau de la mer) et Bufo spinulosus trifolium avaient des courbes presque identiques. Si les courbes ont été obtenues aux températures ambiantes, le Bufo spinulosus flavolineatus a montré une très faible teneur en O2 et une affinité élevée pour l’hémoglobine par rapport aux deux autres sous-espèces. Chez Bufo spinulosus flavolineatus, le DH’ élevé indique une sensibilité élevée de l’affinité de l’hémoglobine aux changements de température ambiante, et le facteur Bohr élevé indique également une sensibilité élevée de l’affinité de l’hémoglobine aux changements de pH sanguin.
DISCUSSION
Le genre Bufo est répandu dans les pays andins. Bufo spinulosus a trois sous-espèces dont les niches sont situées dans les pentes andines inférieures, les vallées intermédiaires (3000 m) et les plaines les plus élevées (au-dessus de 4000 m). La sous-espèce d’altitude intermédiaire Bufo spinulosus trifolium et la sous-espèce de niveau de la mer Bufo spinulosus limensis ne diffèrent pas dans leurs valeurs hématologiques. Le Bufo spinulosus flavolineatus de haute altitude a une concentration d’hémoglobine beaucoup plus faible, mais les caractéristiques des globules rouges sont similaires aux deux autres sous-espèces. Les RBC semblent être plus petits que ceux des deux autres sous-espèces, contrairement aux résultats de Ruiz(9), qui indiquaient le contraire. On sait que le genre Bufo a une concentration d’hémoglobine plus élevée que les autres amphibiens. Hutchinson et Szarki (3) attribuent cela à la vascularisation élevée et à l’habitude terrestre. Cependant, Bufo spinulosus flavolineatus a une très faible concentration en hémoglobine.
Dans les trois groupes, l’étude électrophorétique de l’hémoglobine montre des individus dont le profil électrophorétique présente deux bandes d’hémoglobine clairement distinctes. Il n’y a pas de différence dans l’affinité de l’hémoglobine entre Bufo spinulosus trifolium et Bufo spinulosus limensis à 20ºC, alors que celle dans le Bufo spinulosus flavolineatus est plus élevée. Lorsque les affinités ont été étudiées aux températures ambiantes où vivent les animaux, Bufo spinulosus trifolium présentait des courbes de dissociation de l’oxygène qui se déplaçaient modérément vers la gauche de Bufo spinulosus limensis, et Bufo spinulosus flavolineatus présentait un décalage très marqué, indiquant une affinité très élevée pour l’hémoglobine.
Les mammifères et les oiseaux indigènes de haute altitude ont tendance à avoir des affinités élevées avec l’oxygène dans le sang et à ne pas présenter de polycythémie à haute altitude (5). Il serait intéressant d’observer si ces réponses à l’hypoxie ambiante et au froid sont présentes chez les animaux ectothermiques. En théorie, le froid devrait aider à augmenter la tolérance à la haute altitude car il diminue le taux métabolique. Dans le cas de Bufo spinulosus flavolineatus, dont la température diurne sous les roches à 4100 m est d’environ 10ºC et d’environ 6ºC ou moins la nuit dans les étangs où ils reposent à moitié immergés, la forte affinité indique une pression de sélection vers l’hypoxie malgré une possible réduction du taux métabolique. Packard et Stiverson (7) n’ont pas trouvé de relation entre l’altitude et la concentration d’hémoglobine chez la rainette faux-grillon (Pseudacris triseriata), mais la plage d’altitude dans leur étude (1500 m et 3000 m) était faible.
L’affinité de l’hémoglobine est une marque génétique apparemment sélectionnée par l’environnement hypoxique chez les vertébrés. Chez les mammifères et les oiseaux, l’affinité est une propriété plutôt fixe qui n’augmente pas en hypoxie et ne disparaît pas en normoxie (6). Chez les poissons, en revanche, l’oxygène sanguin augmente nettement en cas d’hypoxie (13).
D’un point de vue comparatif, il existe quelques similitudes entre les ectothermes et les endothermes. Il a été constaté qu’il existe une certaine corrélation entre l’affinité de l’hémoglobine et l’altitude chez les sous-espèces de souris occupant un gradient altitudinal (11). Il a également été montré qu’au sein d’une même espèce de mammifères vivant le long d’un gradient vertical dans les Andes, les individus vivant dans la gamme la plus élevée ont des hémoglobines avec une affinité plus élevée que les individus vivant dans la gamme la plus basse. Ces différences étaient plus importantes dans le cas du renard des Andes, où deux espèces distinctes occupent les deux extrêmes de la plage d’altitude (4).
Ce travail renforce le concept selon lequel la polycythémie n’est pas sélectionnée comme paramètre adaptatif à l’environnement hypoxique. Au contraire, l’hémoglobine à haute affinité semble être fortement sélectionnée chez une variété d’animaux vivant en haute altitude.
REMERCIEMENTS
Nous remercions le Dr Roy E. Weber pour son aide à clarifier notre réflexion sur ce sujet et pour la révision du manuscrit.
Auteur correspondant: Hrvoj Ostojic P. – Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chili. Téléphone: (56-57) 420599, Télécopieur: (56-57) 427683, courriel: [email protected]
Reçu le: 13 août 1999. Acceptée sous forme révisée : 6 mai 2000
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