Il est crucial d’avoir le contrôle du titre viral dans le travail expérimental avec des virus. Pour faciliter les comparaisons entre les études réalisées dans différents laboratoires, l’utilisation de méthodes normalisées harmonisées est souhaitable. Pour l’herpèsvirus humain 6 (HHV-6), un β-herpèsvirus auquel la plupart des gens ont été exposés, la méthode de dose d’infectiosité par culture tissulaire à 50% (TCID50) est souvent utilisée pour l’évaluation du titre viral. Une lecture couramment utilisée est l’inspection oculaire pour les effets cytopathiques (CPE), c’est-à-dire l’élargissement des cellules infectées. Un obstacle avec cette approche est que les cellules peuvent s’agrandir même lorsqu’elles ne sont pas infectées. C’est particulièrement difficile à la limite de l’infection dans les séries de titrage, car les cellules agrandies en raison de l’infection ont tendance à s’agrandir moins avec une dilution accrue du virus (fichier supplémentaire 1: Figure S1). Le test d’immunofluorescence (IFA) est une approche alternative de lecture de l’inspection oculaire dans l’évaluation TCID50 ou pour le calcul des unités infectieuses, c’est-à-dire la fraction de cellules infectées. La lecture basée sur l’IFA est plus distincte pour distinguer les cellules infectées des cellules non infectées, mais la coloration est laborieuse et un nombre substantiel de cellules doit être compté pour obtenir des valeurs fiables. La surveillance de cellules individuelles implique un risque de mauvaise interprétation de la positivité d’une cellule, un inconvénient à la fois de l’inspection oculaire et des lectures basées sur l’IFA. Par conséquent, nous avons développé et validé une approche alternative de lecture du TCID50 où l’augmentation de la charge d’ADN viral est mesurée dans chaque puits de titrage des plaques de culture du TCID50 en utilisant la PCR quantitative en temps réel (Q-PCR). Cette approche a été comparée à l’inspection oculaire et aux lectures IFA du TCID50, ainsi qu’à l’approche des unités infectieuses décrite ci-dessus.
Le HHV-6A (souche GS) a été propagé dans la lignée de lymphocytes T HSB-2 dans du GlutaMAX contenant du milieu RPMI 1640 (Invitrogen, Royaume-Uni) additionné de 10% de sérum de bovin fœtal (HyClone, UT), de 100 U/ml de pénicilline et de 100 µg/ml de streptomycine (Invitrogen). Lorsqu’environ 50% des cellules vivantes se sont agrandies, le surnageant a été récolté et congelé immédiatement en aliquotes à -80°C jusqu’à analyse. Comme témoins, le surnageant viral du passage 17 (P17) a été inactivé par la lumière UV pendant 20 min ou par un traitement thermique à 56°C pendant 1 h. La réplication du HHV-6A dans des cellules HSB-2 a été suivie pendant dix jours en utilisant Q-PCR (Applied Biosystems, Royaume-Uni) comme décrit précédemment. Avant l’analyse Q-PCR, l’ADN a été extrait des suspensions cellulaires à l’aide d’un kit à base de billes de plaques à 96 puits selon le protocole du fabricant (Kit d’isolement d’ARN viral MagMAX-96, Applied Biosystems). Pour évaluer la teneur en ADN du HHV-6A dans les lots viraux, la Q-PCR a été réalisée comme décrit ci-dessus après extraction d’ADN à l’aide de colonnes filtrantes (QIAGEN GmbH, Allemagne).
Pour mettre en place les plaques de culture TCID50, des suspensions cellulaires de 40 µl 104 cellules HSB-2 par puits ont été ensemencées dans des plaques de culture à fond rond à 96 puits. Les cellules ont été inoculées pendant 3-4 heures avec 160 µl de dilutions quintuplées de surnageant HHV-6A, six répliques par dilution. Des contrôles simulés et moyens ont été inclus dans des puits en trois exemplaires sur toutes les plaques. Les cellules ont été lavées une fois avant que 50 à 70 µl de suspension cellulaire soient prélevés dans chaque puits et stockés à -80 ° C sous forme d’échantillons post-infection zéro jour (dpi). Les suspensions cellulaires restantes ont été incubées pendant sept jours à 37°C. À sept dpi, la plaque zéro dpi décongelée et les sept plaques dpi ont été soumises à une extraction d’ADN à l’aide du kit à base de billes décrit ci-dessus. Ensuite, l’ADN viral a été quantifié par Q-PCR comme décrit ci-dessus.
Pour l’IFA, les cellules ont été fixées sur des lames de verre avec un mélange 1:1 d’acétone et de méthanol à -20°C pendant 10 minutes, bloquées par 5% de sérum de chèvre et 3% de BSA dans du PBS, et colorées avec un anticorps monoclonal primaire de souris spécifique de la glycoprotéine HHV-6 gp116/54/64 (Advanced Biotechnologies, MD). La coloration a été visualisée par une IgG conjuguée anti-souris de chèvre Alexa 633 (Invitrogen). Une coloration au 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (Vector laboratories, CA) a été utilisée pour visualiser les noyaux cellulaires. Les lames de couverture ont été montées avec des supports de montage (DAKO A/S, Danemark) et les lames ont été analysées à l’aide d’un microscope confocal (Leica Microsystems, Allemagne). La fraction de cellules infectées a été déterminée par comptage manuel. Si ≥1/3 des cellules contenaient des protéines virales, ≥25 cellules par puits étaient comptées et si < 1/3 des cellules contenaient des protéines virales, ≥100 cellules par puits étaient comptées. Des puits où ≥2 % des cellules colorées positives étaient considérées comme infectées. Le niveau d’augmentation de la charge d’ADN viral dans chaque puits a été corrélé à la coloration IFA construisant une formule dans le logiciel Excel (Microsoft, WA). Cette formule demande si l’ADN viral dans un certain puits de la plaque TCID50 s’est déplacé un certain nombre de fois, ce qui est défini, et si le même puits était positif dans IFA ou non.
Pour des comparaisons avec la lecture Q-PCR, toutes les plaques TCID50 ont été évaluées par inspection oculaire à l’aide d’un microscope à contraste de phase par deux inspecteurs indépendants (TCID50 oculaire). Les puits étaient considérés comme infectés si au moins une cellule agrandie était trouvée. Pour les deux approches de lecture, le TCID50 a été calculé selon la formule de Reed et de Muench.
Les résultats du TCID50 déterminés par Q-PCR (Q-PCR TCID50) ont été comparés à l’évaluation des unités infectieuses par l’IFA (communication personnelle avec Louis Flamand) à trois moments pour P19 et un pour P27. En bref, 2,5 * 105 cellules HSB-2 ont été inoculées comme décrit ci-dessus avec diverses dilutions de virus dans des puits en trois exemplaires pour chaque dilution. À deux dpi, les cellules ont été soumises à l’IFA ciblant la protéine virale précoce p41 (clone 9A5D12, Santa Cruz Biotech. Inc., CA) comme décrit ci-dessus. Le titre viral, exprimé en unités infectieuses par ml, a été calculé en multipliant la fraction de cellules infectées par le nombre total de cellules à zéro dpi et les facteurs de dilution.
Pour déterminer le point de temps optimal pour les mesures d’augmentation de la charge d’ADN viral, la réplication du virus a été suivie pendant dix jours. Sept jours ont été nécessaires pour atteindre une augmentation suffisante de l’ADN viral (figure 1) et ont donc été choisis comme moment de récolte. Pour définir le point de coupe de l’augmentation relative de l’ADN viral correspondant à une infection positive, l’augmentation de la charge d’ADN viral a été corrélée à l’expression de la protéine virale. L’IFA a été réalisée à sept dpi sur des cellules de chaque puits dans trois plaques TCID50 pour deux lots de virus différents. Le point de coupe optimal s’est avéré être une augmentation de dix fois de l’ADN viral, où la corrélation avec l’expression des protéines a été observée dans 93% des puits (figure 2).
Réplication du HHV-6A (souche GS) suivie d’une Q-PCR. Les données présentées sont des résultats moyens (± MEB) de cultures triples pour chaque multiplicité d’infection (MOI). Les lignes de connexion s’interrompent lorsque la charge d’ADN viral chute sous la limite de détection.
Détermination du point de coupure pour l’infection. Le point de coupure optimal pour l’infection s’est avéré être une augmentation de dix fois où la corrélation avec l’expression des protéines a été observée dans 93% des puits par l’IFA avec un anticorps ciblant la protéine virale tardive gp116/54 / 64. Aucune protéine virale bien contenue où la charge d’ADN viral n’avait pas été multipliée par dix. Les données présentées sont des résultats moyens (± SEM) de trois plaques TCID50.
En comparant les valeurs de TCID50 Q-PCR à TCID50 oculaire et IFA, une TCID50 Q-PCR a égalé 1,41 TCID50 oculaire et 1,03 TCID50 IFA sur la base de 13 ou 5 évaluations respectivement. La Q-PCR TCID50 n’a pas donné de valeurs statistiquement différentes par rapport à la TCID50 oculaire ou IFA (p = 0,41 ou p = 0,29 respectivement) (test t apparié) (tableau 1).
Les numéros de copie d’ADN viral sont souvent utilisés comme estimation approximative de la quantité de particules virales qu’un lot viral particulier contient. Cependant, on ne sait pas dans quelle mesure cela correspond à l’infectiosité. Pour évaluer cela, les valeurs de TCID50 ont été comparées aux numéros de copie d’ADN viral du lot respectif. Les rapports moyens de la charge d’ADN viral aux valeurs de TCID50 Q-PCR dans les lots de virus étaient similaires pour P17 et P19; 6,3 * 105 et 2,0 * 106 copies d’ADN viral par TCID50 respectivement. Pour P21 cependant, le rapport était considérablement plus élevé, 1,3* 108 copies d’ADN viral par TCID50 (tableau 1). Ainsi, la mesure de l’ADN viral dans les surnageants du lot est insuffisante pour attribuer correctement l’infectiosité d’un lot et des tests biologiques doivent donc être effectués pour déterminer avec précision les titres viraux.
Le coefficient de variation (CV) intra-dosage moyen pour la PCR-Q TCID50 était de 9%, déterminé par des extractions en double parallèles et des PCR-Q de trois plaques de culture TCID50. Pour le TCID50 oculaire, le CV intra-dosage était de 45%, déterminé par un total de douze plaques de culture TCID50 lues par deux évaluateurs indépendants. Le CV intra-dosage était de 14% pour l’IFA TCID50 déterminé par deux colorations parallèles de cellules de deux séries. Pour l’approche des unités infectieuses, le CV intra-dosage a été déterminé à 43% par quatre colorations parallèles de cellules d’un cycle. Le CV inter-dosage moyen était de 73% pour le TCID50 Q-PCR et de 66% pour le TCID50 oculaire, déterminé pour trois lots de virus exécutés cinq, trois et trois fois respectivement. Pour l’IFA TCID50, le CV inter-dosage était de 25%, déterminé pour un lot trois fois. Pour l’approche des unités infectieuses, le CV inter-dosage était de 77%, déterminé par trois essais distincts pour un lot.
En résumé, la méthode Q-PCR TCID50 décrite ici est bien corrélée à l’expression des protéines virales et présente donc une spécificité élevée pour la dose infectieuse. Il est plus robuste que le TCID50 oculaire, le TCID50 IFA et l’approche des unités infectieuses, sur la base des valeurs CV intra-test. Le CV intra-dosage est dans ce cadre une mesure de la précision d’une certaine approche de lecture et constitue donc la valeur la plus précise pour les comparaisons des différentes méthodes. Pour adapter la méthode, le point de coupe doit être déterminé pour chaque souche virale testée et chaque lignée cellulaire utilisée. L’approche de lecture Q-PCR est plus laborieuse que l’inspection oculaire, mais à notre avis beaucoup moins laborieuse que l’IFA TCID50 et l’approche des unités infectieuses. Il est plus coûteux en ressources de laboratoire que l’inspection oculaire, l’IFA TCID50 et l’approche des unités infectieuses. Cependant, nos données soulignent l’importance d’effectuer des tests biologiques pour déterminer avec précision les titres viraux, ce qui pourrait justifier le coût et la main-d’œuvre. En outre, une meilleure standardisation des méthodes d’évaluation des titres viraux utilisées dans le domaine du HHV-6 pourrait accroître la concordance entre les différentes études.