Matériaux et méthodes
Préparation de l’ADN duplex. Pour fabriquer les molécules d’ADN duplex de 30 pb, deux oligonucléotides avec la séquence et les modifications suivantes ont été hybridés (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). L’oligonucléotide 5′-GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ a été marqué par Cy5 à son extrémité 5′ et par Cy3 à son extrémité 3′. L’oligonucléotide complémentaire a été marqué avec de la biotine aux deux extrémités.
Expression et purification des protéines. Le gène de la protéine fluorescente jaune (YFP) dans le plasmide p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (un don de H. Lee Sweeney, Université de Pennsylvanie, Philadelphie) a été supprimé par PCR. Le plasmide p2Bac/pFastBac-M5-CaM qui en résulte code pour la myosine V de poulet tronquée à Glu-1099. Une fermeture éclair à la leucine suivait la bobine enroulée native pour assurer la dimérisation. Pour faciliter la purification, la protéine myosine V a été étiquetée N-terminale avec une étiquette-DRAPEAU (DYKDDDDK). Deux baculovirus recombinants ont été générés pour l’expression des protéines dans les cellules Sf9. On a codé la myosine V tronquée et la calmoduline Drosophila melanogaster dérivée du plasmide p2Bac/pFastBac-M5-CaM. Le second virus a codé la chaîne légère essentielle humaine dérivée du plasmide p2Bac/pFastBac-ELC. Les deux virus ont été utilisés pour la co-infection des cellules Sf9. La protéine a été exprimée et purifiée comme décrit par Sweeney et al. (20).
Marquage et échange de Calmoduline. La calmoduline a été exprimée et marquée par Cy3 ou Cy5 comme suit : Une seule cystéine a été introduite dans la calmoduline d’oursin au moyen de la mutation Q143C. Cette calmoduline a été exprimée dans Escherichia coli et purifiée comme décrit dans ref. 21. La calmoduline a été marquée avec des solutions mères de Cy3-maléimide ou de Cy5-maléimide (Amersham Biosciences) (dans du DMSO) à un rapport molaire de 1,4 fois pendant 20 min. L’excès de colorant a été éliminé par filtration sur gel dans le tampon d’échange (ci-dessous), suivi d’une absorption hydrophobe pendant la nuit sur les biobilles (Bio-Rad). L’incorporation de l’étiquette était de 102 % pour la Cy3-calmoduline et de 75 % pour la Cy5-calmoduline. Les aliquotes ont été conservées à -80°C.
L’échange de calmoduline marquée sur la myosine V a été effectué comme décrit mais avec quelques modifications (22). La myosine V (150 nM) a été incubée avec de la calmoduline marquée au Cy3 à 0,7 nM et de la calmoduline marquée au Cy5 à 0,8 nM dans un tampon d’échange (25 mm KCl / 20 mm imidazole HCl, pH 7,4 / 2 mm MgCl2 / 1 mm EGTA) à 22 ° C pendant 2 min. Pour échanger les calmodulines, on ajoute 0,9 mm de CACL 2 et on incube le mélange à 22°C pendant 5 min. La réaction a été éteinte avec de l’EGTA de 7 mM. Le mélange réactionnel a été appliqué sur un dispositif d’ultrafiltration Nanocep (Pall) de 100K MWCO et lavé trois fois avec des volumes égaux d’AB (ci-dessous) pour purifier la myosine V de l’excès de calmoduline.
Préparation des cellules d’écoulement. La cellule d’écoulement a été construite avec une lame de microscope en verre et des couvercles hautement réfractants en NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) maintenus ensemble par des morceaux de scotch double face.
Pour les expériences sur la myosine V, 15 µl de biotine-BSA (1 mg · ml-1) ont été incubés dans la cellule d’écoulement pendant 2 min, après quoi 30 µl de tampon AB (25 mm KCl / 25 mm imidazole HCl, pH 7,4 / 1 mm EGTA / 4 mm MgCl2 / 10 mm DTT / 1 mg · ml-1 BSA) ont traversé la cellule d’écoulement pour le laver. Quinze microlitres de 0,5 mg / ml de neutravidine (Sondes moléculaires) ont été ajoutés à la cellule et ont été laissés à incuber pendant 2 min, après quoi un autre lavage a été effectué avec du tampon AB. La cellule d’écoulement a été incubée avec 15 µl de filaments d’actine de phalloïdine biotinylés (250 nM) pendant 5 min, suivie d’un lavage de 100 µl avec du tampon AB. Enfin, la cellule a été chargée avec 20 µl de tampon d’imagerie comprenant de la myosine V échangée à la calmoduline, de la calmoduline 5 µM, de l’ATP 300 nM, un système de régénération de l’ATP (0,1 mg · ml-1 créatine phosphokinase / 1 mm de phosphate de créatine) et du Triton-X 100 à 0,5% (vol / vol) pour réduire la liaison non spécifique. La cellule a été scellée avec de la graisse sous vide et imagée immédiatement. La concentration motrice finale a abouti à une actine peu décorée et a ainsi permis une analyse de molécules uniques de myosine V.
Pour les expériences sur l’ADN, la biotine-BSA et la neutravidine ont été chargées de la même manière que pour les expériences sur la myosine V, mais les lavages ont été effectués avec du tampon T50 (Tris 10 mM, pH 8,0/ 50 mm NaCl). Une fois que la cellule d’écoulement avait un revêtement de neutravidine, 15 µlof dsDNA (30 nM) dans du tampon T50 avec 1 mg · ml-1 BSA ont été introduits et incubés pendant 2 min, après quoi 100 µl de tampon d’imagerie ont été introduits. La cellule d’écoulement a ensuite été scellée avec de la graisse sous vide et rapidement imagée. La décoration résultante des molécules d’ADN à la surface était suffisamment clairsemée pour que les taches fluorescentes de différentes molécules se chevauchent rarement.
Configuration du microscope. Le microscope à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) a été mis en place comme décrit dans la réf. 8, avec quelques modifications (Fig. 5, qui est publié à l’appui sur le site Web du PNAS). Des faisceaux de sources d’excitation à 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) et 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) ont été combinés par un miroir dichroïque et étendus à un diamètre de 7 mm. Ces sources ont été focalisées (distance focale = 500 mm) sur le plan focal arrière d’un objectif TIRF Olympus 1,65 NA ×100 au moyen d’une ligne laser dichroïque sur un étage de translation linéaire qui permet le fonctionnement du microscope en mode épifluorescence ou TIRF. L’objectif a été placé sous un étage de nanotranslation piézo-électrique à deux axes en boucle fermée équipé de capteurs capacitifs pour la mesure de position (Physik Instrumente, Auburn, MA). La lumière réfléchie sortant de l’ouverture arrière de l’objectif a été dirigée sur une photodiode quadrant pour fournir un signal pour une boucle de rétroaction de mise au point qui a serré la distance entre l’objectif et l’échantillon avec un actionneur électrostrictif (Newport, Fountain Valley, CA). L’émission de fluorescence a été collectée par l’objectif, passée à travers deux filtres à encoche à couche mince StopLine (Semrock, Rochester, NY), un pour chaque source d’excitation, et transmise par un appareil à double vue qui permettait l’imagerie simultanée des canaux Cy3 et Cy5 sur une seule caméra iXon DV 887 EMCCD (Andor Technology, Belfast, Irlande). Toutes les données ont été imagées avec un temps d’intégration de 0,5 seconde. La diaphonie entre les deux canaux (10%) biaise vraisemblablement les mesures de distance vers des valeurs plus petites. Notre erreur expérimentale, cependant, la rend indétectable, comme le montrent les simulations de Monte Carlo dans lesquelles 100 paires d’images modélisées de fluorophores simples séparés de 10 nm ont été créées et analysées de manière identique aux données d’ADN (décrites ci-dessous). Des images simulées de fonctions d’étalement de points fluorescents ont été calculées en générant une distribution d’intensité gaussienne 2D intégrée avec un fond constant auquel le bruit de tir a été ajouté. Les pics simulés avaient les mêmes dimensions et le même rapport signal sur bruit que les pics réels. Les données simulées avec 10% de diaphonie et les données simulées sans diaphonie sont indiscernables par un test de Kolmogorov-Smirnov (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Analyse des données. Une cartographie d’enregistrement des canaux Cy3 et Cy5 a été réalisée avec des repères constitués de billes de TransFluoSphère de 100 nm (Sondes moléculaires). Ils étaient excités à 532 nm et émettent avec un large spectre d’émission. La perle était détectable dans nos deux canaux. Nous avons localisé un seul bourrelet associé à la lamelle, et avec notre étage piézo-électrique, nous l’avons incrusté avec une précision nanométrique dans un motif de grille (avec un espacement de 0,5 µm), en prenant une image à chaque arrêt. Le résultat final a été une pile de 312 images qui montre le cordon dans les deux canaux à des positions différentes (Fig. 1 bis).
Les données ADN ont été analysées par un logiciel maison utilisant matlab (Mathworks, Natick, MA). La routine localise automatiquement les pics dans l’image en déterminant les pixels de forte intensité et garantit que les pixels environnants ont des intensités comme prévu pour un seul fluorophore. Avant d’ajuster les pics à une fonction Gaussienne 2D pour obtenir ses emplacements centraux, nous recherchons des paires de pics. Les pixels trouvés dans le canal Cy5 sont mappés sur le canal Cy3 et une recherche de pics dans les pixels Cy3 environnants est effectuée. Si un pic est trouvé, le pic Cy5 et le pic Cy3 sont considérés comme une paire pour une analyse plus approfondie. Chaque pic est adapté à une fonction gaussienne 2D dans son espace respectif comme décrit pour les perles ci-dessus (Eq. 1 ). L’erreur sur l’emplacement moyen de l’ajustement est calculée avec le nombre de photons (Ny) collectés, 
L’emplacement du Cy5 est mappé sur le canal Cy3 et la distance entre eux est calculée. Après l’analyse informatique des données d’ADN, les paires de fluorophores identifiées ont été criblées manuellement pour s’assurer que les paires n’étaient pas proches d’autres fluorophores qui auraient interféré dans l’analyse des paires.
Les données sur la myosine V ont été analysées en identifiant d’abord un moteur en mouvement à l’œil nu. Un logiciel maison écrit dans matlab a ensuite adapté la paire de pics fluorescents de départ aux fonctions gaussiennes 2D décrites ci-dessus et a continué à suivre les pics aussi longtemps que l’utilisateur l’a spécifié. Des moteurs dont les colorants conjugués ont chacun été photoblanchés en une seule étape ont été analysés, comme ce fut le cas pour la plupart des moteurs observés, ce qui nous a permis d’étudier effectivement des moteurs avec une seule étiquette Cy3 et une étiquette Cy5. Les trajectoires résultantes ont été enregistrées en mappant la trajectoire Cy5 sur le canal Cy3. Un ajustement linéaire des moindres carrés aux points des deux trajectoires a donné l’orientation du filament d’actine sur lequel les trajectoires étaient projetées. Les distances le long de l’ajustement linéaire (le filament d’actine) ont été tracées en fonction du temps pour voir les distances relatives des têtes (Fig. 4).
Trace temporelle d’une molécule de myosine V marquée différentiellement marchant le long d’un filament d’actine. Les étiquettes (Cy3 et Cy5) sont attachées de manière covalente aux calmodulines qui ont été échangées sur la molécule de myosine V. Dans cette trace, les deux emplacements de la sonde fluorescente font des pas de 72 nm, ce qui indique que les calmodulines ont été échangées à proximité du domaine moteur. Les positions alternées des sondes permettent une observation directe du mécanisme de marche main sur main de myosine V.