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Pseudomonas aeruginosa est une bactérie environnementale gram négative omniprésente présente dans le sol et l’eau. C’est également un agent pathogène opportuniste qui provoque des infections chez les personnes présentant des défauts immunitaires innés, y compris les patients atteints de fibrose kystique (FC) (8). P. aeruginosa rencontre des environnements à faible teneur en oxygène dans le sol et l’eau. Les preuves indiquent que chez les humains atteints de mucoviscidose, les bactéries peuvent, au moins en partie, se trouver dans un environnement pauvre en oxygène dans des masses mucopurulentes ou des biofilms dans les voies respiratoires (19). P. aeruginosa est capable de croître de manière anaérobie en présence d’accepteurs d’électrons terminaux, tels que le nitrate (NO3−), le nitrite (NO2−) et le protoxyde d’azote (N2O), ou lorsque la l-arginine est un substrat pour la croissance (21). Le mucus des voies respiratoires est suffisamment riche en NO3 – et NO2 – pour soutenir la croissance anaérobie de P. aeruginosa (7, 19). Dans cette étude, une comparaison du protéome de P. aeruginosa pendant la croissance en présence et en absence d’oxygène a été réalisée.

P. la souche aeruginosa PAO1 obtenue de Steve Lory (Harvard Medical School, Boston, MA) a été cultivée dans des flacons de 125 ml dans du bouillon Luria (LB) additionné de 1% de KNO3 avec agitation à 200 tr/ min à 37 °C pour une croissance aérobie. La croissance anaérobie a été complétée comme décrit précédemment (9) dans 80 ml de milieu dans des flacons de sérum Wheaton de 100 ml (Fisher Scientific) avec des bouchons en caoutchouc. Le milieu a été privé d’oxygène en étant soumis à un bullage avec du gaz N 2 pendant 1 h. Pour les conditions aérobies et anaérobies, les bactéries ont été récoltées à la phase logarithmique tardive de la croissance, à quel point la densité cellulaire (densité optique à 600 nm) de la culture anaérobie était de 44% de la densité de la culture aérobie. Il n’y avait pas de différence significative entre le pH des cultures récoltées (pH 7,6 pour la culture anaérobie et pH 7,4 pour la culture aérobie). Quantités égales de protéines de cellules entières dénaturées et réduites (2.0 mg de chaque état de croissance) ont été marqués avec un réactif ICAT (Applied Biosystems, Foster City, CA), léger (12C) ou lourd (13C), traité et analysé comme décrit précédemment (3). Les données rapportées sont les moyennes d’au moins deux expériences indépendantes.

Six cent dix protéines de P. aeruginosa ont été identifiées et quantifiées à l’aide d’ICAT (pour une liste complète des protéines, voir le tableau S1 dans le matériel supplémentaire). Parmi les 151 protéines dont l’abondance a changé au cours de la croissance anaérobie, 76 étaient plus abondantes (Tableau (Tableau1)1) et 75 étaient plus abondantes (Tableau (Tableau2).2). Comme prévu, 13 protéines qui participent à la croissance anaérobie et à la dénitrification (y compris les produits des gènes nir, nos et nar) ont été exprimées à des niveaux plus élevés pendant la croissance anaérobie (Tableau (Tableau1).1). Ces résultats suggèrent que les changements observés dans la teneur en protéines comprennent ceux résultant spécifiquement de la croissance à différents niveaux d’oxygène.

Les changements dans le protéome détecté pourraient également refléter des différences dans toute la régulation dépendante de la densité en plus des effets de la tension de l’oxygène, étant donné la densité cellulaire relative plus faible de la culture anaérobie récoltée. En effet, 29 protéines détectées en plus faible abondance dans des cellules cultivées anaérobiquement sont codées par des gènes précédemment montrés induits par la détection du quorum (5, 16, 17). Ceux-ci comprennent les sous-unités de cyanure d’hydrogène synthase HcnB et HcnC; les Pseudomonas quinolone signalent les enzymes biosynthétiques PqsB, PqsC et PqsD; et PhnB (Tableau (Tableau2).2). Conformément à nos résultats, les gènes hcn et pqs ont également été réprimés transcriptionnellement pendant la croissance anaérobie par une analyse récente de microréseaux d’ADN utilisant des cultures aérobies et anaérobies récoltées à la même densité cellulaire (1) (Tableau (Tableau22).

Pour identifier le P sécrété. protéines d’aeruginosa avec des niveaux modifiés au cours de la croissance anaérobie, les protéines surnageantes de culture ont été concentrées (11) et séparées par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) (Fig. (Figue.1).1). Quatre bandes protéiques colorées en Coomassie, correspondant à des protéines exprimées différentiellement, ont été identifiées et analysées comme dans une étude précédente (4) (Fig. (Figue.1).1). Les abondances de trois protéines sécrétées semblaient diminuer au cours de la croissance anaérobie : la protéine de liaison à la chitine CbpD, l’élastase LasB et une protéine de fonction inconnue codée par PA0572. Des études protéomiques antérieures ont révélé que ces trois protéines sont induites par la détection du quorum (11). Une protéine a semblé augmenter en abondance pendant la croissance anaérobie et a été identifiée soit comme la protéine du filament flagellaire FliC, soit comme la protéine de capsulage flagellaire FliD (en raison du chevauchement des caractéristiques de ces deux protéines).

La plupart des protéines de la membrane externe de P. aeruginosa ne contiennent pas de résidus de cystéine et ne peuvent donc pas être analysées par ICAT(4). Par conséquent, la PAGE bidimensionnelle (2D) a été utilisée comme méthode complémentaire (4). Plusieurs protéines de la membrane externe (Fig. (Figue.2) 2) ont été excisés du gel 2D et identifiés (4). L’OprÉ semble augmenter en abondance pendant la croissance anaérobie, tandis que l’OprF et l’OprH semblent diminuer en abondance (Fig. (Figue.2).2). Les trois protéines ont migré sous forme d’espèces multiples lors de la focalisation isoélectrique (Fig. (Figue.2).2). La diminution de l’abondance de l’OprF au cours de la croissance anaérobie a été confirmée par l’immunoblot des protéines de la membrane externe (données non montrées), à l’aide d’un antisérum polyclonal anti-OprF (un cadeau de Robert Hancock, Université de la Colombie-Britannique à Vancouver, Canada).

Parmi les protéines de P. aeruginosa qui ont montré une abondance accrue pendant la croissance anaérobie (Tableau (Tableau1;1; Fig. Figue.1), 1), plusieurs contribuent aux fonctions impliquées dans la formation et le développement des biofilms. Ces protéines comprennent la protéine de contrôle de la répression des catabolites Crc et les protéines de motilité de contraction PilU, PilG et ChpA (12, 13, 18). Conformément à une augmentation du taux de Crc dans les cellules cultivées en anaérobie (Tableau (Tableau1), 1), les cibles connues de répression du Crc ont diminué en abondance (Tableau (Tableau2), 2), y compris les produits du gène hmgA et bkd (6, 10). Le ChpA et le PilG sont des composants d’un système de régulation complexe contrôlant la motilité des contractions (18). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que l’expression ou la fonction des appendices de surface cellulaire qui affectent la formation de biofilm est altérée pendant la croissance anaérobie. De tels changements peuvent contribuer à l’augmentation de la formation de biofilm observée chez P. aeruginosa en croissance anaérobie (20).

En plus des changements dans les protéines de la membrane externe observés pendant la croissance anaérobie, l’analyse de l’ICAT a montré que plusieurs enzymes impliquées dans la biosynthèse du lipopolysaccharide (LPS) de P. aeruginosa étaient exprimées à des niveaux plus élevés pendant la croissance anaérobie (Tableau (Tableau1).1). Ceux-ci comprenaient un homologue de la bêta-hydroxylase LpxO2, qui hydroxyle les acides gras lipidiques A (14); les heptosyltransférases de base LPS WaaC et WaaF (2, 15); et WbpG, qui est codé par un groupe de gènes qui participe à la synthèse d’un antigène O de longue bande B. Ces résultats suggèrent que la teneur en LPS pourrait être modifiée à la suite de l’anaérobiose.

En résumé, le protéome de P. aeruginosa change de manière significative au cours de la croissance anaérobie. Nous avons identifié 617 protéines au total : 610 par analyse ICAT, 4 par analyse de PAGE SDS et 3 par analyse de PAGE 2D. Sur les 617 protéines identifiées, l’abondance de 158 variait entre les cellules cultivées en anaérobie et celles cultivées en aérobie. Comme P. aeruginosa a atteint une densité cellulaire plus faible dans nos conditions de croissance anaérobie que dans les conditions de croissance aérobie, des changements d’expression protéique dépendants de la densité peuvent avoir contribué au protéome que nous avons détecté pendant la croissance anaérobie. Néanmoins, la densité cellulaire bactérienne est susceptible d’être également limitée dans de nombreuses niches environnementales où de multiples nutriments (y compris l’oxygène) sont rares. Par conséquent, les changements dans les niveaux de protéines que nous avons détectés contribuent à comprendre comment le protéome et l’état métabolique des bactéries varient en réponse à différents environnements. L’analyse directe de la teneur en protéines bactériennes est une technologie robuste pour observer l’adaptation des bactéries à des niches environnementales spécifiques, y compris les voies respiratoires des FC.