a DNS-gélelektroforézis a DNS-fragmensek méret szerinti szétválasztására és azonosítására szolgáló technika.
a különböző méretű DNS-fragmenseket agarózból – a vörös algákban található szénhidrátból-készült porózus gélbe töltik.
elektromos mező alkalmazásakor a fragmensek a gélen keresztül vándorolnak, a DNS-nukleotidok negatív töltésű foszfátcsoportjainak köszönhetően.
a kisebb DNS-darabok könnyebben vándorolnak át a gélen, mint a nagyobb fragmensek, amelyek nehezebben mozognak a gélmátrixon.
amikor a gélfutás befejeződött, a DNS-minták helyét összehasonlíthatjuk ismert méretű fragmentumok vagy sávok sorozatával, úgynevezett DNS-létrával.
ezután az érdeklődésre számot tartó töredék jelenléte megerősíthető annak mérete alapján, amelyet úgy határozunk meg, hogy összehasonlítjuk a tesztminta relatív helyét a létra töredékeivel.
az Agarózgéleket tömeg / térfogat százalékos oldat alkalmazásával állítjuk elő. Tehát 1 gramm agaróz 100 ml pufferben 1% – os gélt eredményez. Az alacsonyabb százalékos gélek jobban oldják meg a nagyobb töredékeket, a magasabb százalékos gélek pedig megkönnyítik a kisebb töredékek azonosítását. A gélkészítési eljárás megkezdéséhez mérjük ki a megfelelő mennyiségű agarózt egy Erlenmeyer-lombikba.
adjunk hozzá futó puffert a lombikba úgy, hogy a puffer térfogata ne legyen nagyobb, mint a lombik kapacitásának 1/3-a. Ezután keverjük össze.
az agaróz/puffer keveréket mikrohullámú sütőben maximális teljesítményen történő melegítéssel megolvasztjuk. Harminc másodpercenként vegye ki a lombikot, és forgassa meg a tartalmát, hogy jól összekeveredjen. Ismételje meg, amíg az agaróz teljesen fel nem oldódik.
Ezután adjunk hozzá etidium-bromidot 0,5 mg/ml koncentrációhoz. Az etidium-bromid egy aromás vegyület, amely illeszkedik az egyes DNS-bázispárok vagy interkalátok közé, és a DNS intenzív narancssárga fluoreszcenciát bocsát ki UV fény alatt. Fontos megjegyezni, hogy az etidium-bromid rákkeltő anyag, ezért az ezt a vegyületet tartalmazó gélek kezelésekor mindig kesztyűt kell viselni.
a géltálca elhajlásának megakadályozása érdekében hagyja kihűlni az agarózt egy 65 oc-os vízfürdőbe helyezve.
amint az agaróz lehűl, készítse elő a gélformát úgy, hogy a gél tálcát az öntőberendezésbe helyezi. Alternatív megoldásként szalaggal lezárhatja a gél tálca nyitott széleit a forma létrehozásához. A fésű behelyezése a gélbe létrehozza azokat a kutakat, ahol a DNS betöltődik. Győződjön meg arról, hogy a fésű olyan kutat hoz létre, amely megfelelő méretű a DNS-mintájához.
öntse az olvadt agarózt a gélformába, és hagyja szobahőmérsékleten megkeményedni.
Miután az agaróz megkeményedett, vegye ki a fésűt. Ha a gélt nem használják fel azonnal, csomagolják műanyag csomagolásba, és használatig 4 CAC-on tárolják.
ha a gélt azonnal fel kell használni, tegye a géldobozba.
ennek az eljárásnak a megkezdéséhez adjon gélfeltöltő festéket az elválasztandó DNS-mintákhoz. A festék betöltése általában 6x koncentrációban történik. A festék betöltése segít vizualizálni és betölteni a mintákat a kutakba, és segít meghatározni, hogy a minták milyen messzire vándoroltak a futás során.
állítsa a tápegységet a kívánt feszültségre.
most tegyen annyi futó puffert a géldobozba, hogy ellepje a gél felületét. Ügyeljen arra, hogy ugyanazt a futó puffert használja, mint amelyet a gél elkészítéséhez használt.
csatlakoztassa a géldoboz vezetékeit a tápegységhez, majd kapcsolja be. Ne feledje, hogy a DNS negatív töltésű, és az anód felé mozog, ami pozitív, és általában piros színű. Ügyeljen arra, hogy ne csatlakoztassa a fekete vezetéket vagy katódot a géldoboz aljához. Tehát ne felejtse el, ne feledje, hogy a fekete macskák balszerencse vagy negatívak, ezért a fekete katód negatív. Futtassa a gélt pirosra, vagy az anódot. Annak ellenőrzése, hogy mind a géldoboz, mind az áramellátás működik-e; a buborékok megjelenése az elektródákon azt jelzi, hogy az áram áthalad.
távolítsa el a zselés doboz fedelét. Lassan és óvatosan töltse be a DNS-mintákat a gélbe. Ismét a mintában lévő töltőfesték lehetővé teszi, hogy a minta belemerüljön a gélbe, és segít nyomon követni, hogy a minta milyen messzire utazott. A kísérleti mintákkal együtt mindig be kell tölteni egy DNS-méretjelzőt vagy létrát.
helyezze vissza a fedelet. Ellenőrizze még egyszer, hogy az elektródák be vannak-e dugva a tápegység megfelelő nyílásaiba.
kapcsolja be a készüléket. Futtassa a gélt, amíg a festék megfelelő távolságra nem vándorol.
az elektroforézis befejezése után kapcsolja ki az áramellátást, és vegye le a géldoboz fedelét.
távolítsa el a gélt a géldobozból, és engedje le a felesleges puffert a gél felületéről. Helyezze a gél tálcát papírtörlőre, hogy felszívja a fennmaradó futó puffert.
a DNS-fragmensek megjelenítéséhez távolítsa el a gélt a gél tálcáról, és tegye ki ultraibolya fénynek.
a DNS-fragmensnek narancssárga fluoreszcens sávokként kell megjelennie. Készítsen képet a gélről.
a kísérlet végén, megfelelően dobja ki a gélt és a futó puffert intézményenként. Ne feledje, hogy mindig kezelje a gélt és a puffereket kesztyűvel, hogy elkerülje az etidium-bromid expozíciót.
most, hogy látta, hogyan kell elvégezni a DNS-gél-elektroforézist. Vessünk egy pillantást ennek a rendkívül hasznos módszernek néhány downstream alkalmazására és variációjára.
itt látható egy agarózgél-elektroforézis eredménye a PCR-termékek elválasztása után. A gélbe betöltött DNS-fragmensek világosan meghatározott sávokként láthatók. A DNS-szabványt vagy a létrát olyan mértékben kell elválasztani, amely lehetővé teszi a mintasávok méretének hasznos meghatározását. Ebben a példában 765 bázispárból, 880 bázispárból és 1022 bázispárból álló DNS-fragmenseket választunk el egy 1,5% – os agarózgélen egy 2-log DNS-létrával.
a kérdéses DNS-fragmens jelenlétének megerősítése mellett a DNS-gélelektroforézis kombinálható gél tisztítási eljárásokkal. Általában egy borotvapengét használnak a kérdéses DNS-fragmens kivágására, hogy összegyűjthető legyen, és a benne lévő DNS-minta visszanyerhető legyen.
az Agarózgél-elektrofézis kombinálható transzferblottálással is, amely magában foglalja a DNS vagy RNS átvitelét egy cellulózmembránra, ahol radioaktív próbák felhasználhatók specifikus DNS vagy RNS szekvenciák azonosítására az elektroforetikusan elválasztott mintában.
a Standard DNS gélelektroforézis nem ideális 15-20 kb-nál nagyobb molekulatömegű DNS, például genomi DNS elválasztására. A nagy DNS-minták elválasztásához impulzusmező gélelektroforézist alkalmaznak, amely magában foglalja a gél változó vagy pulzáló elektromos mezőnek való alávetését különböző irányokban. Ez a technika egy speciális gélfutó készüléket foglal magában, amelynek elektródapárjai különböző irányokban vannak elrendezve a gél körül. Ezt fel lehet használni a genomméretek közötti különbségek kimutatására az organizmusok populációi között, mint például a különböző mikrobaközösségekből származó összevont DNS-minták, amelyeket itt láthat, amelyek különböző tavi környezetből származnak.
Ön most látott egy bevezetést a DNS gélelektroforézishez. Megmutattuk a módszer mögött meghúzódó koncepciót, az agaróz gél elkészítésének módját, a minták betöltésének módját, a gél futtatásának módját, valamint az agaróz gélelektroforézis néhány gyakori alkalmazásának elemzését. Köszönöm, hogy megnézted, és sok szerencsét a gél futtatásához.