Kináz aktivitással jelölt western blotting assay

a felhalmozódó bizonyítékok arra utalnak, hogy a foszforiláció/defoszforiláció jelátvitel zavarai a sejtek kóros viselkedésével járnak. A foszfo-proteom projektek közel 300 000 foszforilált Ser/Thr/Tyr maradékot azonosítottak a sejtfehérjékben . Ezzel párhuzamosan az emberi genom projekt körülbelül 500 protein-kinázt fedezett fel. Mégis, korlátozott számú protein-kinázt rendeltek az egyes foszforilációs helyekhez.

a gélen belüli foszforilációs vizsgálat kényelmes módszer volt a protein-kináz aktivitás kimutatására az SDS-sel oldott mintákban. Ezt a módszert alkalmazták a CaMKII, MYPT1-K (vagy ZIPK) és mások azonosítására . Ebben a vizsgálati protokollban a protein-kinázokat egy szubsztrát polipeptidbe ágyazott SDS-poliakrilamid gélre töltik, majd renaturációnak, radioaktív ATP alkalmazásával foszforilezésnek vetik alá, majd autoradiográfiával detektálják a foszforilezett szubsztrátot. Ezenkívül a kinázok autofoszforilezését kimutatták nitrocellulóz vagy polivinilidén-fluorid (PVDF) membrán radioaktív ATP alkalmazásával . A radioaktív anyag a biztonsági előírások miatt korlátozást jelenthet a felhasználók számára. Ezenkívül a foszforilezett fehérjék autoradiogramjaiból hiányzik a foszforilációs helyekről szóló információ.

itt nem radioaktív alternatív vizsgálatot optimalizáltunk a hagyományos gélen belüli foszforilációs vizsgálathoz. Nevezett kináz aktivitással jelölt western blot (KAT-WB), ez sikeresen detektálja azokat a Tyr-kinázokat, amelyek autofoszforilálják magukat, valamint a Ser/Thr-kinázokat, amelyek foszfo (P)-specifikus antitestek felhasználásával foszforilálnak egy adott helyen érdekes szubsztrátfehérjét.

az 1.ábra a Tyr-kináz autofoszforilezési vizsgálat KAT-WB adatait mutatja. Ahhoz, hogy duplikált blotokat készítsünk, két alikvot kivonatot töltöttünk egy SDS poliakrilamid gélre, elektroforézisnek vetettük alá, majd a fehérjéket egy PVDF membránlapra helyeztük (0,2 MHz). A membránt egymás után pufferelt 2-propanollal, 6,0 M guanidin-hidrokloriddal (Gu-HCl), 3,0 M Gu-HCl-lel, 0,1 M gu-HCl-lel és renaturációs pufferrel kezeltük (lásd a kiegészítő protokollt). Egy éjszakán át tartó renaturációs lépés után 4 6CC-nél a membránt hosszában levágtuk, hogy két duplikált darabot hozzunk létre (1.ábra). Egy darab membránt inkubáltunk 60 percig 1 mM-es MgATP-vel. A másik membrándarabot mgatp nélkül inkubáltuk kontrollként. Mindkét lapot egyidejűleg immundetektálásnak vetettük alá anti-P-Tyr antitesttel (PY20 klón 1:5000 hígítással). Amint az 1. ábrán látható, több P-Tyr sávot detektáltunk 100, 70, 45 és 35 kDa-nál a kontrollmembránon (bal felső sarokban). Ezeket a P-Tyr fehérjéket feltehetően már az extrakció előtt foszforilálták. Az elválasztás után az mgatp-vel történő inkubáció megemelte a fehérje Tyr-foszforilációját 45 kDa-nál a szívizom lizátumaiban (1.ábra, jobb felső rész, 2. sáv), jelezve a Tyr-maradékok autofoszforilációját ebben a kinázban a membránon renaturációt követően. Az 1. ábra a 2. sáv denzitogrammjait mutatja (- /+ MgATP). Annak ellenőrzésére, hogy a fehérje egyenértékű-e a két bloton, a szűrőket Coomassie festésnek vetettük alá (1.ábra, alsó rész). Technikai megjegyzés, hogy a módszer kidolgozása során megállapítottuk, hogy a pufferolt 2-propanollal és 6M Gu-HCl-lel végzett kezelések egyaránt szükségesek voltak a kinázaktivitás kimutatásához. Ezért a KAT-WB 45-kDa Tyr kinázt észlelt.

A KAT-WB másik változata a PVDF membránon abszorbeált szubsztrát fehérje helyspecifikus foszforilezését használja a kináz közelében. A foszfatáz holoenzim inhibitort-1-et (PHI-1) használtuk érdekes fehérjeként, amelynek foszforilációja a Thr57-nél ezt a sejtfehérjét az 1-es típusú ser/Thr foszfatáz inhibitorává alakítja . A 2A. ábra KAT-WB adatokat mutat be pozitív kontrollként rekombináns zipk, egy ser / Thr kináz felhasználásával, amelyről ismert, hogy a rekombináns PHI-1-et foszforilálja a Thr57-en . A denaturálás és a lépcsőzetes renaturálás után a membránt egy éjszakán át átitatjuk a rekombináns PHI-1 vad típussal (WT) vagy egy nem foszforilálható változattal (T57H) kiegészített renaturációs pufferben, 0,2 mg/ml-en, majd a foszforilációs reakciót MgATP-vel lefuttatjuk. A foszforilált PHI-1-et a membránon anti-P-PHI-1 (Thr57) antitesttel detektáltuk , és ez a rekombináns ZIPK sávját tárta fel. A PHI-1 nélküli vezérlőmembránokon vagy a PHI-1 T57H változatával azonban csak halvány jelet észleltek. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a membránon lévő renaturált kinázok képesek foszforilálni azokat a szubsztrátumokat, amelyek szintén felszívódnak a membránra. A KAT-WB – t több PHI-1 kináz kimutatására alkalmazták a szövetekben és a sejtekben (2b.ábra). Patkányváz, szívizmok és Neuro2a sejtek kivonatait KAT-WB vizsgálatnak vetettük alá. A no-ATP kontrollhoz (bal, felső) képest a P-PHI-1 jelei megjelentek az 1 mM-es mgatp-vel inkubált blot-on (jobb, felső). A P-PHI-1 prominens sávjait a Neuro2a sejtlizátumokban 100, 60 és 49 kDa-nál (3.sáv, nyitott nyílhegy) detektálták. Azonban a P-PHI-1 sávjai nem voltak nyilvánvalóak a csontváz és a szívizmok kivonataival (1.és 2. sáv). A P-PHI-1 jelet a PHI-1 nélküli foszforilezési lépés nem javította (2.ábra, alsó, üres: BLK). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy több PHI-1 kináz expresszálódik az idegsejtekben, de nem a csontvázban vagy a szívizomban. Ez hatékony eszközt biztosít számunkra több szubsztrát-specifikus kináz kimutatására a sejtekben és szövetekben. Technikai megjegyzés, hogy a foszforilációs jelek kimutatásához szükséges volt a PHI-1 éjszakai renaturálása, és hogy a PHI-1 magasabb koncentrációja nem növelte a festés intenzitását (nem látható).

ezen adatok alapján azt javasoljuk, hogy a KAT-WB képes detektálni a Tyr kinázok autofoszforilációját és az érdeklődésre számot tartó szelektív szubsztrát fehérjék helyspecifikus foszforilációját a szövetekben és sejtekben jelen lévő több protein kináz által. A KAT-WB lényegében megosztja a hagyományos gélen belüli foszforilációs vizsgálat előnyeit, amely kinázaktivitást detektál egy nyers keverékben, például sejtkivonatokban, felfedve molekuláris méretüket . E két vizsgálat további előnye, hogy a sejtekben a kinázok poszttranszlációs módosításai (PTMs) a kívánt időpontban, meghatározott körülmények között megőrizhetők, mivel az ezekhez a vizsgálatokhoz használt minták gyorsan denaturálódnak a pufferrel, beleértve az SDS-t is, kiküszöbölve a kivonatokban a foszforilációt és a defoszforilációt . A legtöbb protein-kinázt a PTM szabályozza. A KAT-WB képes monitorozni a kináz aktivitás ingadozásait, még akkor is, ha a szabályozó PTM-eket még nem kell jellemezni. A KAT-WB nem képes kimutatni az összes kinázt a sejtkivonatokban, mert csak azok a monomer enzimek mutatnak aktivitást, amelyek az alkalmazott körülmények között hatékonyan megújulnak. A KAT-WB módosításainak azonban képesnek kell lenniük a kalmodulin és ciklinek által szabályozott kinázok kimutatására, ahogyan azt gélen belüli foszforilációs vizsgálattal tették . A renaturációs hatékonyság javulása és az immunprecipitációval/immunodepletionnal és kináz antitestekkel történő kombináció növelheti a megközelítés hasznosságát.

figyelemre méltó, hogy a foszforilezés mellett A KAT-WB protokoll elve alkalmazható más PTM enzimek, például acetilázok, metilázok és ubiquitin ligázok kimutatására is, ha PTM-specifikus antitestek állnak rendelkezésre. A helyspecifikus PTM-eket felismerő antitestek kifejlesztésével együtt az aktivitással jelölt western blotting által lefedett kutatási célokat kibővítik.