a Protein kinázok a legnagyobb enzim szupercsalád, amely részt vesz a sejtjelátvitelben, és számos betegség terápiás célpontját képviselik. Sok labor intenzív erőfeszítéseket tett katalitikus mechanizmusaik megértésére, inhibitorok felfedezésére és sejtfunkcióik felismerésére. Ebben az áttekintésben két megközelítést fogunk leírni, amelyeket a protein-kinázok elemzésére fejlesztettek ki: biszubsztrát analóg gátlás és foszfonát analóg hasznosítás. Mindkét módszert a fehérje-félszintézis módszerrel kombinálva alkalmazták expresszált fehérje ligálás hogy elősegítsük a kináz-szubsztrát kölcsönhatások megértését és a foszforiláció funkcionális tisztázását. A protein-kináz mechanizmus természetével kapcsolatos korábbi munka azt sugallja, hogy disszociatív átmeneti állapotot követ. A biszubsztrát analógot az inzulinreceptor-kináz ellen tervezték, hogy utánozza a disszociatív átmeneti állapot reakció koordinátatávolságának geometriáját. Ez a biszubsztrát vegyület hatékony inhibitornak bizonyult az inzulinreceptor-kináz ellen, és mind a peptid -, mind a nukleotidkötő helyeket elfoglalta. A megváltozott hidrogénkötési potenciállal rendelkező biszubsztrát vegyületek, valamint az adenin és a peptid közötti változó távtartók bizonyítják az eredeti tervezési jellemzők fontosságát. Azt is kimutattuk, hogy a kapcsolódó biszubsztrát analógok felhasználhatók a szerin/treonin kinázok, köztük a protein kináz a hatékony blokkolására. Mivel sok protein-kináz felismeri a hajtogatott fehérje szubsztrátokat a hatékony foszforilezés érdekében, előnyös volt a peptid-ATP konjugátumok beépítése fehérjeszerkezetekbe. Expresszált fehérjeligáció alkalmazásával Src-ATP konjugátumot állítottunk elő, amely nagy affinitású ligandumnak bizonyult a Csk tirozin-kináz számára. A foszfoser/foszfotir nem hidrolizálható utánzatai hasznosak lehetnek a foszforilációs események funkcionalitásának vizsgálatában. Expresszált fehérje ligálás alkalmazásával foszfonometilén-fenilalanint és foszfonometilén-alanint alkalmaztunk a Tyr és a Ser foszforilációjának vizsgálatára. Ezek az eszközök lehetővé tették az SH2-foszfatázok (SHP1 és SHP2) elemzését, feltárva a megfelelő foszforilációs események által közvetített katalitikus aktivitás új intramolekuláris stimulációját. Ezeket a melatonin ritmus enzim sejtszabályozásának foszforilezéssel történő jellemzésére is használták.