Affinità dell’emoglobina per l’ossigeno in tre sottospecie di rospi (Bufo sp.) che vivono a diverse altitudini
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 Clinicum Laboratorio Automatizado, Iquique, Cile
2 Laboratorio de Transporte de Oxígeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia di Lima, Perù
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Cile
ABSTRACT
di ossigeno nel Sangue di affinità e di globuli rossi nel sangue proprietà sono stati misurati in tre sottospecie del genere Bufo: Bufo spinulosus limensis, raccolti a livello del mare e ad una temperatura media di 20 ° c; Bufo spinulosus trifolium, da 3100 m, temperatura media giornaliera di 15ºC; e Bufo spinulosus flavolineatus, da 4100 m, temperatura media giornaliera di 10ºC. L’elettroforesi dell’emoglobina ha mostrato lo stesso componente in ciascuna delle tre sottospecie. A 20ºC le affinità di ossigeno nel sangue (P50) hanno mostrato piccole differenze tra Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium, mentre il valore per Bufo spinulosus flavolineatus era marcatamente inferiore. A 10ºC, la temperatura ambiente di Bufo spinulosus flavolineatus, la P50 era estremamente bassa rispetto alle altre due sottospecie alle loro corrispondenti temperature ambientali.
PAROLE CHIAVE: adattamenti, altitudine, anfibi Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, emoglobina affinità, hematocrits, di legame dell’ossigeno, rospi
INTRODUZIONE
In Perù genere Bufo occupa un gradiente altitudinale che va dal livello del mare sopra i 4000 m. La specie Bufo spinulosus ha tre sottospecie le cui nicchie sono a bassa, media e alta quota. Queste sottospecie sono Bufo spinulosus limensis (bassa quota), Bufo spinulosus trifolium (altitudine intermedia) e Bufo spinulosus flavolineatus (alta quota) (12). Uno degli adattamenti ambientali più intensamente studiati del sistema respiratorio nei vertebrati è quello dell’ipossia, che si verifica variamente in alta quota, nello sviluppo embrionale (ad esempio, in utero) e in ambienti acquatici, in particolare di acqua dolce. Questi adattamenti comportano comunemente cambiamenti nelle proprietà dei globuli rossi, nella capacità di carico dell’ossigeno o nell’affinità dell’ossigeno dell’emoglobina. Intraspecifica adattamenti che si verificano nello stesso animale in condizioni diverse, in genere comportano modifiche in allosterico fattori (cioè, le condizioni alle quali l’emoglobina le funzioni all’interno dei globuli rossi), mentre interspecifici adattamenti, che sono evidenti quando si confrontano diverse specie, sono attribuibili a cambiamenti nelle proprietà delle molecole di emoglobina.
La maggior parte degli studi sugli adattamenti ipossici nelle proprietà dei globuli rossi e dell’emoglobina si riferiscono a pesci e mammiferi e si sa molto poco sui vertebrati ectotermici inferiori. Uno studio precedente ha dimostrato che la rana del lago Titicaca Telmatobius culeus (2) che viveva a 3800 m. aveva un’affinità O2 nel sangue più alta e cellule del sangue più piccole rispetto alle rane del livello del mare. Questo studio descrive gli adattamenti nella sottospecie Bufo.
MATERIALE E METODI
Anuri della sottospecie Bufo spinulosus limensis sono stati raccolti dalle pianure costiere a circa 400 km dal nostro laboratorio a Lima (livello del mare, temperatura media giornaliera 20ºC). Bufo spinulosus trifolium sono stati raccolti nelle Ande centrali peruviane (circa 3100 m, temperatura media giornaliera 15ºC), e Bufo spinulosus flavolineatus anche nelle Ande centrali (a 4100 m, temperatura media giornaliera 10ºC). Gli animali sono stati portati al nostro laboratorio nel giro di poche ore. Il sangue è stato prelevato in siringhe eparinizzate dal cuore di animali precedentemente squartati. Circa 3 ml di sangue potrebbero essere ottenuti da Bufo spinulosus limensis e da 1 a 1,5 ml dalle altre sottospecie. Sangue da due a tre animali sono stati raggruppati al fine di effettuare le determinazioni. La conta dei globuli rossi, la concentrazione di emoglobina e gli ematocriti sono stati misurati con tecniche convenzionali.
L’elettroforesi dell’emoglobina è stata eseguita su strisce di acetato di cellulosa in un tampone specifico per l’elettroforesi dell’emoglobina, e le bande sono state colorate con Ponceau S e lette in un densitometro secondo il manuale di istruzioni di Helena Laboratories (USA).
L’affinità sangue-ossigeno (P50) è stata misurata con la tecnica di miscelazione (1,10) a 10ºC, 15ºC e 20ºC. L’equilibrio ematico è stato effettuato in un tonometro mantenuto a queste temperature utilizzando miscele di gas contenenti il 4,5% di CO2 e concentrazioni variabili di O2 e N2. La saturazione di O2 nel sangue variava tra il 30 e l ‘ 80%. Il phmetro è stato calibrato utilizzando tamponi di fosfato ad alta precisione.
I valori di pH alle temperature di equilibrio (eq) sono stati calcolati da quelli alle temperature di misura (meas) usando l’equazione data da Rosenthal (8):
pHeq = pH meas + 0.0147 (Teq _ Tmeas)
Il fattore di Bohr è stato ottenuto modificando il pH del sangue come segue. Il plasma preparato a partire da aliquote ematiche è stato acidificato con acido lattico o alcalinizzato con idrossido di sodio e ricostituito con i corrispondenti globuli rossi. I campioni di sangue di Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium sono stati equilibrati a 20ºC e 15ºC e il sangue di Bufo spinulosus flavolineatus a 20ºC e 10ºC e a valori di pH diversi per calcolare il fattore di Bohr per ogni temperatura (14). Questo fattore ha permesso il calcolo del pH del sangue standard alle tre temperature. Per calcolare il coefficiente di Hill (n), è stato utilizzato un metodo di approssimazioni successive (10). Un valore dall’equazione di Bohr per ogni sottospecie è stato calcolato dai dati in esperimenti separati.
L’equazione di van’t Hoff è stata utilizzata per calcolare il calore complessivo di ossigenazione DH’ dai valori P50. Per Bufo spinulosus limensis sono stati utilizzati valori a 20ºC e 15ºC prendendo 20ºC come temperatura ambiente. Per Bufo spinulosus trifolium sono stati utilizzati i valori a 15ºC e 20ºC prendendo 15ºC come temperatura ambiente. Per Bufo spinulosus flavolineatus sono stati utilizzati i valori a 10ºC e 20ºC prendendo 10ºC come temperatura ambiente. La significatività statistica è stata determinata dal test t dello studente con il software Systat 6.0 per Windows.
RISULTATI
Le tabelle I e II riassumono i dati ematologici. Non vi è alcuna differenza statistica tra i valori di Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium. I valori dell’ematocrito, dell’emoglobina e della quantità di RBC in Bufo spinulosus flavolineatus sono molto più bassi.
Gli esperimenti di elettroforesi hanno mostrato le stesse distanze di migrazione nelle emoglobine di ciascuna delle tre sottospecie e la presenza di due bande in alcune delle piste (Fig. 4). Non sono stati effettuati ulteriori studi per definire le proprietà dell’emoglobina.
La Tabella II mostra le proprietà funzionali dell’emoglobina nel sangue, rivelando piccole differenze nel P50 tra Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium, mentre il valore per Bufo spinulosus flavolineatus è inferiore. I valori alla temperatura ambiente in cui gli animali sono stati raccolti non differivano significativamente tra Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium. Nel caso di Bufo spinulosus flavolineatus, a 10ºC il valore P50 è molto basso. La figura 1 mostra un diagramma di log P50 rispetto al pH. La figura 2 mostra le curve di dissociazione dell’ossigeno dell’emoglobina costruite con i valori di P50 e il coefficiente di Hill a 20º C. Le curve per Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium sono molto vicine l’una all’altra, mentre quella per il Bufo spinulosus flavolineatus è spostata a sinistra. La figura 3 è un grafico del contenuto di O2 di sangue rispetto a PO2 di sangue alla temperatura ambiente di ciascuna sottospecie. Questo mostra il basso contenuto di O2 e P50 molto basso di Bufo spinulosus flavolineatus e uno spostamento moderato a sinistra di Bufo spinulosus trifolium rispetto a Bufo spinulosus limensis senza riduzione del contenuto di O2 nel sangue in Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium.
Fig. 1: Effetto Bohr in tre sottospecie di Bufo spinulosus. Bufo spinulosus flavolineatus mostra il più grande fattore di Bohr.
Fig. 2: Curva di dissociazione del sangue per le tre sottospecie a pH di 7,84 e 20º C. La curva del Bufo spinulosus flavolineatus è spostata a sinistra.
Fig. 3: Contenuto di emoglobina O2 vs pressione di ossigeno parziale per ogni subspeceis alla rispettiva temperatura ecologica. Bufo Spinulosus limensis (20º C), Bufo spinulosus trifolium (15º C)Bufo spinulosus flavolineatus (10º C). Il contenuto di emoglobina di Bufo spinulosus flavolineatus è inferiore rispetto alle altre due sottospecie e il P50 è molto basso.
Fig. 4: Elettroforesi delle tre sottospecie di Bufo Spinulosus. L’esperimento mostra le stesse distanze di migrazione nelle emoglobine di ciascuna delle tre sottospecie e la presenza di due bande in alcune delle piste.
Questi risultati mostrano che a -20 ° c Bufo spinulosus flavolineatus, il cui habitat naturale è vicino a 4000 m e la cui temperatura ambiente medie 10ºC, ha un basso contenuto di emoglobina e una alta affinità dell’emoglobina rispetto a Bufo spinulosus trifolium, la cui media temperatura ambiente altitudine è vicino a 3000 m e il cui ambiente temperatura media è di 15 ° C. Bufo spinulosus limensis (livello del mare) e Bufo spinulosus trifolium avevano curve quasi identiche. Se le curve sono state ottenute a temperature ambiente, il Bufo spinulosus flavolineatus ha mostrato un contenuto di O2 molto basso e un’elevata affinità di emoglobina rispetto alle altre due sottospecie. In Bufo spinulosus flavolineatus, l’alto DH ‘ indica un’alta sensibilità dell’affinità dell’emoglobina ai cambiamenti della temperatura ambiente e l’alto fattore di Bohr indica anche un’alta sensibilità dell’affinità dell’emoglobina ai cambiamenti del pH del sangue.
DISCUSSIONE
Il genere Bufo è diffuso nei paesi andini. Bufo spinulosus ha tre sottospecie le cui nicchie si trovano nei versanti andini inferiori, nelle valli intermedie (3000 m) e nelle pianure più alte (sopra i 4000 m). La sottospecie di altitudine intermedia Bufo spinulosus trifolium e la sottospecie di livello del mare Bufo spinulosus limensis non differiscono nei loro valori ematologici. Il Bufo spinulosus flavolineatus di alta quota ha una concentrazione di emoglobina molto più bassa, ma le caratteristiche dei globuli rossi sono simili alle altre due sottospecie. I globuli rossi sembrano essere più piccoli di quelli delle altre due sottospecie, a differenza dei risultati di Ruiz (9), che indicavano il contrario. È noto che il genere Bufo ha una concentrazione di emoglobina più elevata rispetto ad altri anfibi. Hutchinson e Szarki (3) attribuiscono questo all’elevata vascolarizzazione e all’abitudine terrestre. Tuttavia, Bufo spinulosus flavolineatus ha una concentrazione di emoglobina molto bassa.
Nei tre gruppi, lo studio elettroforetico dell’emoglobina mostra individui il cui modello elettroforetico presenta due bande di emoglobina chiaramente separate. Non c’è differenza nell’affinità dell’emoglobina tra Bufo spinulosus trifolium e Bufo spinulosus limensis a 20ºC, mentre quella nel Bufo spinulosus flavolineatus è più alta. Quando le affinità sono state studiate alle temperature ambiente in cui vivono gli animali, Bufo spinulosus trifolium aveva curve di dissociazione dell’ossigeno che si spostavano moderatamente a sinistra di Bufo spinulosus limensis, e Bufo spinulosus flavolineatus mostrava uno spostamento molto marcato, indicando un’affinità di emoglobina molto elevata.
I mammiferi e gli uccelli nativi ad alta quota tendono ad avere elevate affinità di ossigeno nel sangue e non a mostrare policitemia ad alta quota (5). Sarebbe interessante osservare se queste risposte all’ipossia ambientale e alle condizioni di freddo sono presenti negli animali ectotermici. In teoria, le condizioni di freddo dovrebbero aiutare ad aumentare la tolleranza ad alta quota perché diminuisce il tasso metabolico. Nel caso di Bufo spinulosus flavolineatus, la cui temperatura diurna sotto le rocce a 4100 m è di circa 10ºC e circa 6ºC o meno di notte negli stagni dove riposano a metà immersi, l’alta affinità indica una pressione di selezione verso l’ipossia nonostante una possibile riduzione del tasso metabolico. Packard e Stiverson (7) non hanno trovato una relazione tra altitudine e concentrazione di emoglobina nella rana chorus (Pseudacris triseriata), ma la gamma di altitudine nel loro studio (1500 me 3000 m) era piccola.
L’affinità dell’emoglobina è un segno genetico apparentemente selezionato dall’ambiente ipossico nei vertebrati. Nei mammiferi e negli uccelli l’affinità è una proprietà piuttosto fissa che non aumenta nell’ipossia e non scompare nella normossia (6). Nel pesce, d’altra parte, l’ossigeno nel sangue aumenta notevolmente sotto ipossia (13).
Da un punto di vista comparativo, ci sono alcune somiglianze tra ectoterme ed endoterme. È stato trovato che esiste una certa correlazione tra affinità dell’emoglobina e altitudine in sottospecie di topi che occupano un gradiente altitudinale (11). È stato anche dimostrato che all’interno delle stesse specie di mammiferi che vivono lungo un gradiente verticale nelle Ande, gli individui che vivono nella gamma più alta hanno emoglobine con maggiore affinità rispetto agli individui che vivono nella gamma più bassa. Queste differenze erano maggiori nel caso della volpe andina, dove due specie separate occupano i due estremi della gamma di altitudine (4).
Questo lavoro rafforza il concetto che la policitemia non è selezionata come parametro adattivo all’ambiente ipossico. Al contrario, l’emoglobina ad alta affinità sembra essere fortemente selezionata in una varietà di animali che vivono in alta quota.
RINGRAZIAMENTI
Ringraziamo il Dr. Roy E. Weber per il suo aiuto nel chiarire il nostro pensiero su questo argomento e per la revisione del manoscritto.
Autore corrispondente: Hrvoj Ostojic P.-Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Cile. Telefono: (56-57) 420599, Fax: (56-57) 427683, e-mail: [email protected]
Ricevuto: 13 agosto 1999. Accettato in forma riveduta: 6 maggio 2000
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