Le protein chinasi sono la più grande superfamiglia enzimatica coinvolta nella trasduzione del segnale cellulare e rappresentano obiettivi terapeutici per una serie di malattie. Ci sono stati intensi sforzi da parte di molti laboratori per comprendere i loro meccanismi catalitici, scoprire gli inibitori e discernere le loro funzioni cellulari. In questa recensione, descriveremo due approcci sviluppati per analizzare le protein chinasi: inibizione analogica bisubstrata e utilizzo analogico fosfonato. Entrambi questi metodi sono stati utilizzati in combinazione con il metodo di semisintesi delle proteine espresso legatura delle proteine per far progredire la nostra comprensione delle interazioni chinasi-substrato e delucidazione funzionale della fosforilazione. Il lavoro precedente sulla natura del meccanismo della protein chinasi suggerisce che segue uno stato di transizione dissociativo. Un analogo bisubstrato è stato progettato contro la chinasi del recettore dell’insulina per imitare la geometria di una distanza di coordinate di reazione dello stato di transizione dissociativa. Questo composto del bisubstrato si è rivelato essere un inibitore potente contro la chinasi del ricevitore dell’insulina ed ha occupato sia i siti leganti del nucleotide che del peptide. I composti bisubstrati con alterato potenziale di legame dell’idrogeno e diversi distanziatori tra l’adenina e il peptide dimostrano l’importanza delle caratteristiche del progetto originale. Abbiamo anche dimostrato che analoghi bisubstrati correlati possono essere utilizzati per bloccare potentemente serina / treonina chinasi inclusa la protein chinasi A. Poiché molte chinasi proteiche riconoscono substrati proteici piegati per una fosforilazione efficiente, è stato vantaggioso incorporare i coniugati peptide-ATP nelle strutture proteiche. Utilizzando la legatura espressa della proteina, è stato prodotto un coniugato Src-ATP che ha dimostrato di essere un ligando ad alta affinità per la tirosina chinasi Csk. Imitazioni non idrolizzabili di fosfoser / fosfotir possono essere utili per esaminare la funzionalità degli eventi di fosforilazione. Usando la legatura espressa della proteina, abbiamo impiegato phosphonomethylene phenylalanine e phosphonomethylene alanine per sondare la fosforilazione di Tyr e di Ser, rispettivamente. Questi strumenti hanno permesso un’analisi delle SH2-fosfatasi (SHP1 e SHP2), rivelando una nuova stimolazione intramolecolare dell’attività catalitica mediata dai corrispondenti eventi di fosforilazione. Sono stati anche usati per caratterizzare la regolazione cellulare dell’enzima del ritmo della melatonina mediante fosforilazione.