La distribuzione di Poisson, dal nome del matematico francese Siméon Denis Poisson, è la probabilità che si verifichi un dato numero di eventi in un dato periodo di tempo (fisso) se gli eventi si verificano a una velocità costante (nota) e sono indipendenti Si basa su una distribuzione di probabilità discreta, in cui l’insieme dei risultati sono discreti o finiti, come il lancio di una moneta o il lancio di dadi.
Nel contesto di un esperimento di PCR digitale, i risultati discreti sono la presenza o l’assenza del gene bersaglio. Si prevede che le migliaia di singole partizioni prodotte per una reazione PCR digitale seguano una distribuzione di Poisson considerando che le partizioni sono monodisperse e contengono il volume equivalente del mix di campioni.
Se questi parametri non sono soddisfatti e le partizioni presentano polidispersità, il volume del mix di campioni nelle partizioni varierà in gran parte e le partizioni più grandi potrebbero contenere più target rispetto a quelle più piccole, riducendo la precisione della reazione PCR digitale.
In questo articolo, vi guidiamo attraverso il calcolo matematico della legge di Poisson per un esperimento di PCR digitale.
Per un esperimento di PCR digitale, un pozzo contenente il campione partizionato di interesse e un gene bersaglio da quantificare, dobbiamo prima definire le seguenti variabili:
- \(N\): numero totale di analizzabili partizioni nel bene
- \(p\): numero positivo di partizioni per il gene bersaglio
- \(v\): il volume della partizione (in µL), ipotizzato costante
- \(d\): fattore di diluizione utilizzata per diluire il campione dalla riserva per il bene
(ad esempio \(d=10\) significa che il campione è stato diluito 10 volte)
e poi questi altri:
-
\(V = N \ v\) : totale partizione del volume iniettato nel pozzo
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\(C_{0}\) : la concentrazione di geni bersaglio nel bene (in copie/µL)
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\(C = d \ C_{0}\) : concentrazione di geni bersaglio in magazzino (in copie/µL)
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\(\lambda = C_{0} \ v\) : numero medio di geni bersaglio di partizione per il bene
La distribuzione dei geni bersaglio incapsulato nelle partizioni del bene segue una distribuzione di Poisson di parametro \(\lambda\) :
Proba ( partizione incapsula \(\text{$k$}\) geni bersaglio ) \(= \dfrac{\lambda^k}{k!} e^{- \lambda}\)
Viene detta una partizione:
-
“Positivo partizione”, se ha incapsulato almeno 1 gene bersaglio (in questo caso si potrà osservare un fluorescenti partizione al punto finale del processo di amplificazione, quindi la maggior parte di incertezza, c’è in questo “almeno una” condizione)
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“Negativo partizione”, se ha incapsulato 0 gene bersaglio (in questo caso si potrà osservare un non fluorescenti partizione al punto finale del processo di amplificazione)
La distribuzione di positivo partizioni nel bene segue una distribuzione binomiale di probabilità \(1 – e^{-\lambda}\):
- Probabilità (ben contiene \(\text{$p$}\) positivo partizioni \(= {\rm C}_{N}^{p} (1 – e^{-\lambda})^p (e^{-\lambda} )^{N-p} \)
- Probabilità (partizione è negativo) \( = e^{-\lambda} \)
- Probabilità (partizione è positivo) \( = 1 – e^{-\lambda} \)
Se \(N\) è abbastanza grande:
- Proba (partizione è positivo) \(= \dfrac{p}{N} \)
Quindi la formula per il valore stimato di concentrazione è:
\ (C = – \dfrac{d}{v} \ ln{\left (1- \ dfrac{p} {N} \ right)} \)
Se è necessario calcolare automaticamente le concentrazioni stimate dei geni bersaglio, insieme al loro intervallo di confidenza e all’incertezza relativa, è disponibile uno strumento online: Legge di Poisson: andare oltre. Provaci!
Per ulteriori informazioni sulle curve di incertezza, nonché sui limiti di rilevazione e quantificazione, consultare la voce: Intervalli dinamici di rilevazione & Quantificazione.