L’elettroforesi su gel di DNA è una tecnica utilizzata per separare e identificare i frammenti di DNA in base alle dimensioni.
Frammenti di DNA di varie dimensioni vengono caricati in un gel poroso a base di agarosio – un carboidrato trovato nelle alghe rosse.
Quando viene applicato un campo elettrico, i frammenti migreranno attraverso il gel, grazie ai gruppi fosfatici caricati negativamente nei nucleotidi del DNA.
Pezzi più piccoli di DNA migreranno più facilmente attraverso il gel rispetto ai frammenti più grandi, che hanno un tempo più difficile muoversi attraverso la matrice del gel.
Quando la corsa del gel è completa, la posizione dei campioni di DNA può essere confrontata con una serie di frammenti o bande di dimensioni note, chiamate scale di DNA.
La presenza del frammento di interesse può quindi essere confermata in base alla sua dimensione, che viene determinata confrontando la posizione relativa del campione di prova con i frammenti della scala.
I gel di agarosio vengono preparati utilizzando una soluzione percentuale peso su volume. Quindi 1 grammo di agarosio in 100 ml di tampone farà un gel all ‘ 1%. Gel percentuali più basse risolveranno meglio i frammenti più grandi e gel percentuali più alte renderanno i frammenti più piccoli più facili da identificare. Per iniziare la procedura di gelificazione, pesare la massa appropriata di agarosio in una beuta di Erlenmeyer.
Aggiungere il buffer in esecuzione al pallone, in modo che il volume del buffer non sia superiore a 1/3 della capacità del pallone. Quindi ruotare per mescolare.
Sciogliere la miscela agarosio / tampone riscaldando in un forno a microonde alla massima potenza. Ogni trenta secondi, rimuovere il pallone e ruotare il contenuto per mescolare bene. Ripetere fino a quando l’agarosio non si è completamente sciolto.
Successivamente aggiungere bromuro di etidio ad una concentrazione di 0,5 mg / ml. Il bromuro di etidio è un composto aromatico che si inserisce tra le singole coppie di basi del DNA, o intercalati, e fa sì che il DNA emetta un’intensa fluorescenza arancione sotto luce UV. È importante notare che il bromuro di etidio è un agente cancerogeno, quindi i guanti devono essere sempre indossati quando si maneggiano gel contenenti questo composto.
Per evitare che il vassoio del gel si deformi, lasciare raffreddare l’agarosio mettendolo in un bagno d’acqua a 65ºC.
Mentre l’agarosio si sta raffreddando, preparare lo stampo gel posizionando il vassoio del gel nell’apparecchio di colata. In alternativa, è possibile utilizzare il nastro per sigillare i bordi aperti del vassoio del gel per creare lo stampo. Posizionare un pettine nel gel crea i pozzetti in cui viene caricato il DNA. Assicurarsi che il pettine creerà un pozzo che è la dimensione appropriata per il campione di DNA.
Versare l’agarosio fuso nello stampo gel e lasciarlo indurire a temperatura ambiente.
Dopo che l’agarosio si è indurito, estrarre il pettine. Se il gel non viene utilizzato immediatamente, avvolgerlo in un involucro di plastica e conservare a 4ºC fino all’uso.
Se il gel sta per essere utilizzato immediatamente, metterlo nella scatola del gel.
Per iniziare questa procedura, aggiungere un colorante carico di gel ai campioni di DNA da separare. La tintura di carico è tipicamente fatta ad una concentrazione 6X. Il caricamento del colorante aiuta a visualizzare e caricare i campioni nei pozzetti e aiuta a determinare fino a che punto i campioni sono migrati durante la corsa.
Impostare l’alimentazione alla tensione desiderata.
Ora aggiungere abbastanza buffer in esecuzione nella scatola del gel per coprire la superficie del gel. Assicurarsi di utilizzare lo stesso buffer in esecuzione di quello utilizzato per preparare il gel.
Collegare i cavi della scatola del gel all’alimentazione e accenderlo. Ricorda che il DNA è caricato negativamente e si sposterà verso l’anodo, che è positivo e generalmente di colore rosso. Assicurarsi di non collegare il cavo nero, o catodo, al fondo della scatola del gel. Quindi non dimenticare, tieni presente che i gatti neri sono sfortuna, o negativi, e il catodo nero è quindi negativo. Eseguire il gel al rosso, o l’anodo. Per verificare che sia la scatola del gel che l’alimentatore funzionino; la comparsa di bolle sugli elettrodi indica che la corrente sta passando.
Rimuovere il coperchio della scatola del gel. Caricare lentamente e con attenzione i campioni di DNA nel gel. Ancora una volta, il colorante di carico nel campione consente al campione di affondare nel gel e aiuterà a tracciare fino a che punto il campione ha viaggiato. Un marcatore di dimensioni del DNA, o scala, dovrebbe sempre essere caricato insieme ai campioni sperimentali.
Sostituire il coperchio. Controllare due volte che gli elettrodi siano inseriti negli slot corretti nell’alimentatore.
Accendere l’alimentazione. Eseguire il gel fino a quando il colorante è migrato a una distanza appropriata.
Al termine dell’elettroforesi, spegnere l’alimentazione e rimuovere il coperchio della scatola del gel.
Rimuovere il gel dalla scatola del gel e scaricare il tampone in eccesso sulla superficie del gel. Posizionare il vassoio del gel su carta assorbente per assorbire qualsiasi tampone in esecuzione rimanente.
Per visualizzare i frammenti di DNA, rimuovere il gel dal vassoio del gel ed esporre il gel alla luce ultravioletta.
Il frammento di DNA dovrebbe apparire come bande fluorescenti arancioni. Scatta una foto del gel.
Alla fine dell’esperimento, smaltire correttamente il gel e il buffer in esecuzione secondo le norme dell’istituzione. Ancora una volta, ricordarsi di maneggiare sempre il gel e i tamponi in esecuzione con i guanti per evitare l’esposizione al bromuro di etidio.
Ora che hai visto come eseguire l’elettroforesi su gel di DNA. Diamo un’occhiata ad alcune applicazioni downstream e varianti di questo metodo molto utile.
Qui si vede un risultato di elettroforesi su gel di agarosio dopo la separazione dei prodotti PCR. I frammenti di DNA caricati nel gel sono visibili come bande chiaramente definite. Lo standard o la scala del DNA dovrebbero essere separati ad un grado che tiene conto la determinazione utile delle dimensioni delle bande del campione. In questo esempio, frammenti di DNA di 765 coppie di basi, 880 coppie di basi e 1022 coppie di basi sono separati su un gel di agarosio all ‘ 1,5% con una scala di DNA a 2 log.
Oltre a confermare la presenza di un frammento di DNA di interesse, l’elettroforesi su gel di DNA può essere combinata con procedure di purificazione del gel. Tipicamente una lama di rasoio viene utilizzata per tagliare il frammento di DNA di interesse, in modo che possa essere raccolto e il campione di DNA al suo interno recuperato.
L’elettrofesi in gel di agarosio può anche essere combinata con il transfer blotting, che comporta il trasferimento del DNA o dell’RNA in una membrana di cellulosa in cui è possibile utilizzare sonde radioattive per identificare specifiche sequenze di DNA o RNA nel campione separato elettroforeticamente.
L’elettroforesi standard del gel del DNA non è ideale per la separazione di DNA ad alto peso molecolare maggior di 15-20 kb nella dimensione, come DNA genomico. Per separare campioni di DNA di grandi dimensioni, viene utilizzata l’elettroforesi su gel a campo impulsivo, che prevede di sottoporre il gel a un campo elettrico mutevole o pulsante in direzioni diverse. Questa tecnica comporta un apparato di gel specializzato, che ha coppie di elettrodi disposti in diversi orientamenti attorno al gel. Questo può essere usato per rilevare differenze nelle dimensioni del genoma tra popolazioni di organismi, come i campioni di DNA raggruppati da diverse comunità microbiche, che vedete qui che sono presi da diversi ambienti lacustri.
Hai appena visto un’introduzione all’elettroforesi su gel di DNA. Vi abbiamo mostrato il concetto alla base del metodo, come preparare il gel di agarosio, come caricare i campioni, come eseguire il gel e analizzarlo e alcune applicazioni comuni di elettroforesi su gel di agarosio. Grazie per aver guardato e buona fortuna con l’esecuzione del gel.