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Pseudomonas aeruginosa è un batterio gram-negativo ambientale onnipresente trovato nel suolo e nell’acqua. È anche un agente patogeno opportunistico che causa infezioni in individui con difetti immunitari innati, compresi i pazienti con fibrosi cistica (CF) (8). P. aeruginosa incontra ambienti a basso contenuto di ossigeno nel suolo e nell’acqua. Le prove indicano che negli esseri umani con CF, i batteri possono, almeno in parte, trovarsi in un ambiente a basso contenuto di ossigeno all’interno di masse mucopurulente o biofilm all’interno delle vie respiratorie (19). P. aeruginosa è in grado di crescere anaerobicamente in presenza di accettori di elettroni terminali, come nitrato (NO3−), nitrito (NO2−) e protossido di azoto (N2O), o quando la l-arginina è un substrato per la crescita (21). Il muco delle vie aeree CF è sufficientemente ricco di NO3 – e NO2-per sostenere la crescita anaerobica di P. aeruginosa (7, 19). In questo studio, è stato eseguito un confronto del proteoma P. aeruginosa durante la crescita in presenza e assenza di ossigeno.

P. il ceppo aeruginosa PAO1 ottenuto da Steve Lory (Harvard Medical School, Boston, MA) è stato coltivato in flaconi da 125 ml in brodo di Luria (LB) integrato con 1% KNO3 con agitazione a 200 rpm a 37°C per la crescita aerobica. La crescita anaerobica è stata completata come descritto in precedenza (9) in 80 ml di terreno in flaconi di siero di Wheaton da 100 ml (Fisher Scientific) con tappi di gomma. Il mezzo è stato privato di ossigeno essendo sottoposto a gorgogliamento con gas N2 per 1 h. Per entrambe le condizioni aerobiche e anaerobiche, i batteri sono stati raccolti alla fase logaritmica tardiva della crescita, a quel punto la densità cellulare (densità ottica a 600 nm) della coltura anaerobica era il 44% della densità della coltura aerobica. Non c’era differenza significativa fra il pHs delle colture raccolte (pH 7.6 per la coltura anaerobica e pH 7.4 per la coltura aerobica). Quantità uguali di proteine a cellule intere denaturate e ridotte (2.0 mg da ogni stato di crescita) sono stati etichettati con luce (12C) o pesante (13C) clivable isotope-coded affinity tag (ICAT) reagente (Applied Biosystems, Foster City, CA), elaborato, e analizzato come precedentemente descritto (3). I dati riportati sono le medie di almeno due esperimenti indipendenti.

Seicentodieci proteine di P. aeruginosa sono state identificate e quantificate utilizzando ICAT (per un elenco completo delle proteine, vedere la Tabella S1 nel materiale supplementare). Tra 151 proteine la cui abbondanza è cambiata durante la crescita anaerobica, 76 erano più alte in abbondanza (Tabella (Table1) 1) e 75 erano più basse in abbondanza (Tabella (Table2).2). Come previsto, 13 proteine che partecipano alla crescita anaerobica e alla denitrificazione (compresi i prodotti dei geni nir, nos e nar) sono state espresse a livelli più alti durante la crescita anaerobica (Tabella (Tabella1).1). Questi risultati suggeriscono che i cambiamenti osservati nel contenuto proteico includono quelli derivanti specificamente dalla crescita a diversi livelli di ossigeno.

I cambiamenti nel proteoma rilevato potrebbero anche riflettere le differenze in tutta la regolazione dipendente dalla densità oltre agli effetti della tensione dell’ossigeno, data la densità cellulare relativa inferiore della coltura anaerobica raccolta. Infatti, 29 proteine rilevate in minore abbondanza in cellule coltivate anaerobicamente sono codificate da geni precedentemente dimostrati indotti dal quorum sensing (5, 16, 17). Questi includono le subunità idrogeno cianuro sintasi HcnB e HcnC; gli enzimi biosintetici del segnale di Pseudomonas chinolone PqsB, PqsC e PqsD; e PhnB (Tabella (Table2).2). Coerentemente con i nostri risultati, i geni hcn e pqs sono stati anche trovati per essere repressi trascrizionalmente durante la crescita anaerobica da una recente analisi del DNA microarray utilizzando colture aerobiche e anaerobiche raccolte alla stessa densità cellulare (1) (Tabella (Table22).

Per identificare P secreto. proteine aeruginosa con livelli alterati durante la crescita anaerobica, le proteine surnatanti in coltura sono state concentrate (11) e separate mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) (Fig. (Fico.1).1). Quattro bande proteiche colorate di Coomassie, corrispondenti a proteine differenzialmente espresse, sono state identificate e analizzate come in uno studio precedente (4) (Fig. (Fico.1).1). Le abbondanze di tre proteine secrete sembravano diminuire durante la crescita anaerobica: la proteina CbpD che lega la chitina, l’elastasi LasB e una proteina di funzione sconosciuta codificata da PA0572. Precedenti studi proteomici hanno rilevato che tutte e tre queste proteine sono indotte dal quorum sensing (11). Una proteina sembrava essere aumentata in abbondanza durante la crescita anaerobica ed è stata identificata come la proteina del filamento flagellare FliC o la proteina di tappatura flagellare FliD (a causa della sovrapposizione delle caratteristiche di queste due proteine).

La maggior parte delle proteine della membrana esterna di P. aeruginosa non contengono residui di cisteina e quindi non possono essere analizzate da ICAT (4). Pertanto, la PAGINA bidimensionale (2D) è stata utilizzata come metodo complementare (4). Diverse proteine della membrana esterna (Fig. (Fico.2) 2) sono stati asportati dal gel 2D e identificati (4). OprE sembrava aumentare in abbondanza durante la crescita anaerobica, mentre Opf e Oph sembravano diminuire in abbondanza (Fig. (Fico.2).2). Tutte e tre le proteine sono migrate come specie multiple durante la messa a fuoco isoelettrica (Fig. (Fico.2).2). La diminuzione dell’abbondanza di Opf durante la crescita anaerobica è stata confermata dall’immunoblotting delle proteine della membrana esterna (dati non mostrati), utilizzando un antisiero policlonale anti-antisf (un regalo di Robert Hancock, Università della British Columbia a Vancouver, Canada).

Tra le proteine P. aeruginosa che hanno mostrato una maggiore abbondanza durante la crescita anaerobica (Tabella (Table1; 1; Fig. Fico.1), 1), molti contribuiscono alle funzioni coinvolte nella formazione e nello sviluppo dei biofilm. Queste proteine includono la proteina di controllo della repressione catabolita Crc e le proteine della motilità spasmi PilU, PilG e ChpA (12, 13, 18). Coerentemente con un aumento del livello di Crc nelle cellule coltivate anaerobicamente (Tabella (Table1),1), gli obiettivi noti di repressione della Crc sono diminuiti in abbondanza (Tabella (Table2),2), inclusi i prodotti del gene hmgA e bkd (6, 10). ChpA e PilG sono componenti di un complesso sistema normativo che controlla la motilità delle contrazioni (18). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che l’espressione o la funzione delle appendici superficiali cellulari che influenzano la formazione di biofilm è alterata durante la crescita anaerobica. Tali cambiamenti possono contribuire all’aumento della formazione di biofilm osservato per la crescita anaerobica di P. aeruginosa (20).

Oltre ai cambiamenti nelle proteine della membrana esterna osservati durante la crescita anaerobica, l’analisi ICAT ha mostrato che diversi enzimi coinvolti nella biosintesi del lipopolisaccaride P. aeruginosa (LPS) sono stati espressi a livelli più elevati durante la crescita anaerobica (Tabella (Tabella1).1). Questi includevano un omologo di beta-idrossilasi LpxO2, che idrossila gli acidi grassi lipid A (14); LPS core eptosiltransferasi WaaC e WaaF (2, 15); e WbpG, che è codificato da un cluster di geni che partecipa alla sintesi di un lungo antigene B-band O. Questi risultati suggeriscono che il contenuto di LPS potrebbe essere alterato come conseguenza dell’anaerobiosi.

In sintesi, il proteoma P. aeruginosa cambia significativamente durante la crescita anaerobica. Abbiamo identificato 617 proteine in totale: 610 mediante analisi ICAT, 4 mediante analisi SDS-PAGE e 3 mediante analisi 2D PAGE. Delle 617 proteine identificate, le abbondanze di 158 variavano tra le cellule coltivate anaerobicamente e quelle coltivate aerobicamente. Poiché P. aeruginosa ha raggiunto una densità cellulare inferiore nelle nostre condizioni di crescita anaerobica rispetto alle condizioni di crescita aerobica, i cambiamenti dipendenti dalla densità nell’espressione proteica possono aver contribuito al proteoma che abbiamo rilevato durante la crescita anaerobica. Tuttavia, è probabile che la densità delle cellule batteriche sia limitata in modo simile in molte nicchie ambientali in cui i nutrienti multipli (incluso l’ossigeno) sono scarsi. Pertanto, i cambiamenti nei livelli di proteine che abbiamo rilevato contribuiscono a comprendere come il proteoma e lo stato metabolico dei batteri variano in risposta a diversi ambienti. L’analisi diretta del contenuto proteico batterico è una tecnologia robusta per osservare l’adattamento dei batteri alle nicchie ambientali specifiche, compreso le vie aeree di CF.