Hemoglobinaffinitet for oksygen i tre underarter av padder (Bufo sp .) bor i forskjellige høyder
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 Laboratorie Automatizado, Iquique, Chile
2 Laboratorie Transporte Av Okseí, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile
sammendrag
BLODOKSYGENAFFINITET Og RØDE blodcelleegenskaper ble målt I TRE UNDERARTER AV SLEKTEN BUFO: bufo spinulosus liensis, samlet ved Havnivå Og Ved En Gjennomsnittlig Dagstemperatur På 20º; Bufo spinulosus trifolium, fra 3100 m, gjennomsnittlig dagtemperatur PÅ 15 HRYVNIAS; Og Bufo spinulosus flavolineatus, fra 4100 m, gjennomsnittlig dagtemperatur PÅ 10 HRYVNIAS. Elektroforese av hemoglobin viste samme komponent i hver av de tre underartene. VED 20 ④C viste blodoksygenaffiniteter (P50) små forskjeller Mellom Bufo spinulosus liensis Og Bufo spinulosus trifolium, mens verdien For Bufo spinulosus flavolineatus var markant lavere. Ved 10º, omgivelsestemperaturen Til Bufo spinulosus flavolineatus, Var P50 ekstremt lav sammenlignet med de to andre underartene ved deres tilsvarende omgivelsestemperaturer.
NØKKELORD: tilpasninger, høyde, amfibier, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, hemoglobinaffinitet, hematokritter, oksygenbinding, padder
INNLEDNING
i Peru opptar slekten Bufo en høydegradient som strekker seg fra havnivå til over 4000 m. Arten Bufo spinulosus har tre underarter hvis nisjer er i lave, mellomliggende og høye høyder. Disse underartene Er Bufo spinulosus liensis (lav høyde), Bufo spinulosus trifolium (middels høyde) og Bufo spinulosus flavolineatus (høy høyde) (12). En av de mest intensivt studerte miljøtilpasningene i luftveiene hos vertebrater er hypoksi, som forekommer forskjellig i høy høyde, i embryonisk utvikling (f.eks. i utero) og i akvatiske, spesielt ferskvann, miljøer. Disse tilpasningene involverer vanligvis endringer i egenskapene til de røde cellene, i oksygenbærende kapasitet eller i oksygenaffiniteten til hemoglobin. Intraspesifikke tilpasninger, som forekommer i samme dyr under forskjellige forhold, involverer generelt endringer i allosteriske faktorer (dvs.forholdene under hvilke hemoglobin fungerer inne i de røde cellene), mens interspesifikke tilpasninger, som er tydelige når man sammenligner forskjellige arter, skyldes endringer i egenskapene til hemoglobinmolekylene.
De fleste studier på hypoksiske tilpasninger i røde blodlegemer og hemoglobinegenskaper refererer til fisk og pattedyr, og svært lite er kjent om lavere ektotermiske vertebrater. En tidligere studie viste At Lake Titicaca frosk Telmatobius culeus (2) bor på 3800 m. hadde høyere blod O2 affinitet og mindre blodceller enn havnivå frosker. Denne studien beskriver tilpasningene I Bufo underarter.
MATERIALE og METODER
Anuraner Av Underarten Bufo spinulosus liensis ble hentet fra kystslettene på ca 400 km fra vårt laboratorium I Lima (havnivå, gjennomsnittlig dagstemperatur 20º). Bufo spinulosus trifolium ble samlet i De Sentrale Peruanske Andesfjellene (ca. 3100 m, gjennomsnittlig dagstemperatur 15º), Og Bufo spinulosus flavolineatus også i De Sentrale Andesfjellene (ved 4100 m, gjennomsnittlig dagstemperatur 10º). Dyrene ble brakt til laboratoriet innen få timer. Blod ble trukket i hepariniserte sprøyter fra hjerter til tidligere pithed dyr. Omtrent 3 ml blod kan hentes Fra Bufo spinulosus limensis og 1 til 1,5 ml fra de andre underartene. Blod fra to til tre dyr ble samlet for å utføre bestemmelsene. Antall røde blodlegemer, hemoglobinkonsentrasjon og hematokritter ble målt ved konvensjonelle teknikker.
Elektroforese av hemoglobin ble kjørt på celluloseacetatstrimler i en buffer spesifikk for hemoglobinelektroforese, og båndene ble farget Med Ponceau S og lest i et densitometer i henhold Til Helena Laboratories (USA) bruksanvisning.
blod-oksygenaffiniteten (P50) ble målt ved blandeteknikken (1,10) ved 10º, 15º og 20º. Blodlikevekt ble utført i en tonometer opprettholdt ved disse temperaturene ved bruk av gassblandinger inneholdende 4,5% CO2 og variable o2-og N2-konsentrasjoner. Blod o2 metning varierte mellom 30 og 80%. PH-måleren ble kalibrert ved hjelp av fosfatbuffere med høy presisjon.
pH-verdiene ved likevektstemperaturene (eq) ble beregnet ut fra de ved måletemperaturer (meas) ved hjelp av ligningen gitt Av Rosenthal (8):
pHeq = pH meas + 0,0147 (Teq _ Tmeas)
Bohr-faktoren ble oppnådd ved å endre blodets pH som følger. Plasma fremstilt fra alikvoter i blod ble enten surgjort med melkesyre eller alkalisert med natriumhydroksid og rekonstituert med de tilsvarende røde blodcellene. Blodprøvene Fra Bufo spinulosus limensis og Bufo spinulosus trifolium ble ekvilibrert VED 20º og 15º og blodet Fra Bufo spinulosus flavolineatus ved 20º og 10º OG ved forskjellige pH-verdier for å beregne Bohr-faktoren for hver temperatur (14). Denne faktoren tillot beregning av standard blod pH ved de tre temperaturene. For å beregne Hill ‘ s koeffisient (n) ble det brukt en metode for suksessive tilnærminger (10). En Verdi Fra Bohr-ligningen for hver underart ble beregnet ut fra data i separate eksperimenter.
van ‘t Hoff-ligningen ble brukt til å beregne den totale varmen av oksygenering DH’ fra p50-verdiene. For bufo spinulosus limensis-verdier ved 20º og 15º ble det brukt 20º som omgivelsestemperatur. For Bufo spinulosus trifolium ble verdiene ved 15º og 20º brukt med 15º som omgivelsestemperatur. For Bufo spinulosus flavolineatus ble verdiene ved 10º og 20º brukt ved å bruke 10º som omgivelsestemperatur. Den statistiske signifikansen ble bestemt Av Studentens t-test Med Programvare Systat 6.0 For Windows.
RESULTATER
Tabellene I og II oppsummerer hematologiske data. Det er ingen statistisk forskjell mellom verdiene Til Bufo spinulosus liensis Og Bufo spinulosus trifolium. Verdiene av hematokrit, hemoglobin og mengden RBC I Bufo spinulosus flavolineatus er mye lavere.
elektroforeseforsøkene viste de samme migreringsavstandene i hemoglobinene til hver av de tre underartene og tilstedeværelsen av to bånd i noen av løpene (Fig. 4). Ingen videre studier ble utført for å definere hemoglobinegenskapene.
Tabell II viser de funksjonelle egenskapene til hemoglobin i blod, og avslører små forskjeller I P50 Mellom Bufo spinulosus liensis Og Bufo spinulosus trifolium, mens verdien For Bufo spinulosus flavolineatus er lavere. Verdiene ved omgivelsestemperaturen der dyrene ble samlet, var ikke signifikant forskjellig Mellom Bufo spinulosus liensis og Bufo spinulosus trifolium. I Tilfelle Av Bufo spinulosus flavolineatus, VED 10º, Er p50-verdien svært lav. Figur 1 viser et plott av log P50 vs. pH. Figur 2 viser hemoglobin oksygen dissosiasjon kurver konstruert med verdiene Av P50 Og Hill koeffisient ved 20º C. kurvene For Bufo spinulosus liensis Og Bufo spinulosus trifolium er svært nær hverandre, mens Det For Bufo spinulosus flavolineatus er forskjøvet til venstre. Figur 3 er et plott av blod O2 innhold vs. blod PO2 ved omgivelsestemperaturen til hver underart. Dette viser lavt O2-innhold og svært lavt P50 Av Bufo spinulosus flavolineatus og en moderat forskyvning til venstre For Bufo spinulosus trifolium sammenlignet Med Bufo spinulosus limensis uten reduksjon av blodets o2-innhold I Bufo spinulosus limonensis og Bufo spinulosus trifolium.
Fig. 1: Bohr effekt i tre underarter Av Bufo spinulosus. Bufo spinulosus flavolineatus viser den største Bohr-faktoren.
Fig. 2: Blooddissociations kurve for de tre underartene ved pH på 7,84 og 20º C. Kurven Til Bufo spinulosus flavolineatus er forskjøvet til venstre.
Fig. 3: Hemoglobin O2 innhold vs delvis oksygentrykk for hver underart ved den respektive økologiske temperaturen. Bufo Spinulosus limensis (20º C), Bufo spinulosus trifolium (15º C) Bufo spinulosus flavolineatus (10º C). Hemoglobininnholdet I Bufo spinulosus flavolineatus er lavere enn i de to andre underartene, Og P50 er svært lavt.
Fig. 4: Elektroforese av De tre underartene Av Bufo Spinulosus. Forsøket viser de samme migrasjonsavstandene i hemoglobinene til hver av de tre underartene og tilstedeværelsen av to bånd i noen av løpene.
disse resultatene viser AT Ved 20º BUFO spinulosus flavolineatus, hvis naturlige habitat er nær 4000 m og hvis omgivelsestemperatur er gjennomsnittlig 10º, har lavt hemoglobininnhold og høy hemoglobinaffinitet sammenlignet Med Bufo spinulosus trifolium, hvis gjennomsnittlige omgivelseshøyde er nær 3000 m og hvis omgivende gjennomsnittstemperatur ER 15º. Bufo spinulosus limensis (havnivå) og Bufo spinulosus trifolium hadde nesten identiske kurver. Hvis kurvene ble oppnådd ved omgivelsestemperaturer, viste Bufo spinulosus flavolineatus et svært lavt O2-innhold og høy hemoglobinaffinitet sammenlignet med de to andre underartene. I bufo spinulosus flavolineatus indikerer den høye DH’ en høy følsomhet for hemoglobinaffiniteten til endringer i omgivelsestemperatur, og Den høye Bohr-faktoren indikerer også en høy følsomhet for hemoglobinaffinitet til endringer i blodets pH.
DISKUSJON
slekten Bufo er utbredt i andesland. Bufo spinulosus har tre underarter hvis nisjer ligger i nedre andes bakker, mellomliggende daler (3000 m) og de høyeste slettene (over 4000 m). De mellomliggende høyde underartene Bufo spinulosus trifolium og havnivå underartene Bufo spinulosus liensis er ikke forskjellige i deres hematologiske verdier. Den høye høyden Bufo spinulosus flavolineatus har en mye lavere hemoglobinkonsentrasjon, men de røde cellens egenskaper ligner de to andre underartene. Rbcene ser ut til å være mindre enn de i De to andre underartene, i motsetning Til Ruizs (9) funn, som indikerte motsatt. Det er kjent at slekten Bufo har en høyere hemoglobinkonsentrasjon enn andre amfibier. Hutchinson Og Szarki (3) tilskriver dette til den høye vaskulariseringen og terrestriske vanen. Bufo spinulosus flavolineatus har imidlertid svært lav hemoglobinkonsentrasjon.
i de tre gruppene viser hemoglobinelektroforetisk studie individer hvis elektroforetiske mønster presenterer to klart separate hemoglobinbånd. Det er INGEN forskjell i hemoglobinaffiniteten Mellom Bufo spinulosus trifolium og Bufo spinulosus liensis VED 20º, mens det i Bufo spinulosus flavolineatus er høyere. Når slektskapene ble studert ved omgivelsestemperaturene der dyrene lever, hadde Bufo spinulosus trifolium oksygen dissosiasjonskurver som skiftet moderat til venstre For Bufo spinulosus liensis, og Bufo spinulosus flavolineatus viste et veldig markert skifte, noe som indikerer en svært høy hemoglobinaffinitet.
høytliggende innfødte pattedyr og fugler har en tendens til å ha høyt blod oksygenforhold og ikke å vise polycytemi i høy høyde (5). Det ville være interessant å observere om disse responsene på omgivende hypoksi og kalde forhold er tilstede hos ektotermiske dyr. I teorien bør kalde forhold bidra til å øke toleransen mot høy høyde fordi den reduserer metabolismen. I Tilfelle Av Bufo spinulosus flavolineatus, hvis dagtemperatur under bergarter på 4100 m er ca. 10º og CA. 6º eller mindre om natten i dammer hvor de hviler halvt nedsenket, indikerer høy affinitet seleksjonstrykk mot hypoksi til tross for en mulig reduksjon i metabolsk hastighet. Packard Og Stiverson (7) fant ikke et forhold mellom høyde og hemoglobinkonsentrasjon i chorus frosken (Pseudacris triseriata), men høydeområdet i studien (1500 m og 3000 m) var liten.
hemoglobinaffiniteten er et genetisk merke som tilsynelatende er valgt av det hypoksiske miljøet hos vertebrater. Hos pattedyr og fugler er affiniteten en ganske fast egenskap som ikke øker i hypoksi og ikke forsvinner i normoksi (6). I fisk øker derimot blodoksygenet markant under hypoksi (13).
fra et komparativt synspunkt er det noen likheter mellom ektotermier og endotermier. Det er funnet at det er en viss sammenheng mellom hemoglobinaffinitet og høyde i underarter av mus som opptar en høydegradient (11). Det har også vist seg at innenfor samme pattedyrarter som lever langs en vertikal gradient i Andesfjellene, har individer som bor i det høyeste området hemoglobiner med høyere affinitet enn individer som bor i det laveste området. Disse forskjellene var større i Tilfelle Av Andesrev, hvor to separate arter okkuperer de to ekstremer av høydeområdet (4).
dette arbeidet forsterker konseptet om at polycytemi ikke er valgt som en adaptiv parameter til det hypoksiske miljøet. Tvert imot synes høyaffinitetshemoglobin å være sterkt valgt i en rekke dyr som lever i høy høyde.
TAKK
vi takker Dr. Roy E. Weber for hans hjelp til å klargjøre vår tenkning om dette emnet og for å gjennomgå manuskriptet.
Korresponderende Forfatter: Hrvoj Ostojic P.-Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chile. Telefon: (56-57) 420599, Faks: (56-57) 427683, e – post: [email protected]
Mottatt: 13.August 1999. Akseptert i revidert form: 6 Mai 2000
BIBLIOGRAFI
1. EDWARDS MJ, MARTIN RJ (1966). Blanding teknikk for oksygen-hemoglobin likevekt Og Bohr effekt. J Appl Physiol 21:1898-1902
2. HUTCHINSON VH, HAINES HB, ENGEBRETSON G (1976) vannlevende liv i høy høyde: Respiratoriske tilpasninger I Titicacasjøen frosk, Telmatobius culeus. Respir Physiol 2:115-119.
3. HUTCHINSON VH, SZARSKI H (1965) Antall erytrocytter i noen amfibier og reptiler. Copeia: 373-375
4. LEON-VELARDE F, DE MUIZON C, PALACIOS JA, CLARK D, MONGE-C C (1996) Hemoglobinaffinitet og struktur i høytliggende og havnivå rovdyr Fra Peru. Comp Biochem Physiol 113a:407-411
5. MCCUTCHEON FH HALL FG (1937) Hemoglobin i Amfibien. J Celle & Komp Physiol 9:191-197
6. MONGE C, LEON-VELARDE F (1991) Fysiologisk tilpasning til høy høyde: oksygentransport hos pattedyr og fugler. Physiol Rev 71: 1135-1172
7. PACKARD G C STIVERSON RK (1976) blodhemoglobinkonsentrasjon i kor frosk (Pseudacris triseriata): forhold til kroppsstørrelse og høyde. Am Midl Nat 96: 482-487
8. ROSENTHAL TB (1948) effekten av temperatur på pH i blod og plasma in vitro. J Biol Chem 173:25-30
9. RUIZ G, ROSENMANN M, VELOSO A. (1989) Høydefordeling og blodverdier i padden, Bufo spinulosus Wiegmann. Comp Biochem Physiol 94A: 643-646
10. SCHEID P, MEYER M (1978) Blandingsteknikk for studier av oksygen-hemoglobinlikevekt: en kritisk evaluering. J Appl Physiol 45: 818-822
11. SNYDER GK, SVART CP, BIRCHARD GF (1982) Utvikling og metabolisme under hypoksi i embryoer av høy høyde Anser indicus versus havnivå Branta canadensis gjess. Physiol Zool 55:113-123
12. VELLARD J (1959) Er kjent for å ha batracios andinos V: el gé Bufo. Velg En Javier Prado Og Velg Enº 8
13. WEBER RE (1992) Molekylære strategier i tilpasninger av virveldyr hemoglobin funksjon I: WOOD SC, WEBER RE, HARGENS AR, MILLARD RW (eds) Physiol tilpasninger i virveldyr, New York: Marcel Dekker
14. WINSLOW RM, MORRISSEY JM, BERGER RL, SMITH PD, GIBSON CC (1978 )Variasjon av oksygenaffinitet av normalt blod: en automatisert målemetode. J Appl Physiol: Respirat Miljø Trening Physiol 45 (2): 289-297