Kinase activity-tagged western blotting assay

Akkumulerende bevis tyder på at forstyrrelser i fosforylering/defosforyleringssignalering er forbundet med patologisk oppførsel av celler. Fosfo-proteom-prosjekter har identifisert nesten 300,000 fosforylerte Ser / Thr / Tyr-rester i cellulære proteiner . Parallelt avdekket human genome project omtrent 500 proteinkinaser. Likevel har et begrenset antall proteinkinaser blitt tildelt hvert fosforyleringssted.

in-gel fosforyleringsanalysen har vært en praktisk metode for å oppdage proteinkinaseaktiviteter i prøver som er oppløselige med SDS. Denne metoden ble brukt for identifisering Av CaMKII, MYPT1-K (ELLER ZIPK) og andre . I denne analyseprotokollen lastes proteinkinaser på EN sds-polyakrylamidgel innebygd med et substratpolypeptid, og underkastes deretter renaturering, fosforylering ved bruk av radioaktivt ATP, etterfulgt av autoradiografi for å oppdage fosforylert substrat. I tillegg har autofosforylering av kinaser blitt påvist på nitrocellulose eller polyvinylidenfluorid (PVDF) membran ved bruk av radioaktivt ATP . Det radioaktive materialet kan være en begrensning for brukere, på grunn av sikkerhetsforskrifter. I tillegg mangler autoradiogrammer av fosforylerte proteiner informasjon om fosforyleringssteder.

her optimaliserte vi en ikke-radioaktiv alternativ analyse til den tradisjonelle fosforyleringsanalysen i gel. Kalt kinase activity-tagged western blotting (KAT-WB), oppdager dette vellykket Tyr-kinaser som autofosforylerer seg selv, så Vel som Ser/Thr-kinaser som fosforylerer et substratprotein av interesse på et bestemt sted ved hjelp av fosfo (P)-spesifikke antistoffer.

Figur 1 viser kat-WB-data for Tyr-kinase autofosforyleringsanalyse. For å lage dupliserte blotter ble to alikvoter av et ekstrakt lastet på EN sds polyakrylamidgel, underkastet elektroforese, og deretter ble proteiner overført til ET ARK MED PVDF-membran (0,2 µ). Membranen ble sekvensielt behandlet med bufret 2-propanol, 6,0 m guanidinhydroklorid (Gu-HCl), 3,0 M Gu-HCl, 0,1 M Gu-HCl og renatureringsbuffer (Se Tilleggsprotokoll). Etter et renatureringstrinn over natten ved 4°C ble membranen kuttet i lengderetningen for å generere to dupliserte stykker (Figur 1). Ett stykke membran ble inkubert i 60 min med 1 mM MgATP. Det andre stykket membran ble inkubert uten MgATP, som en kontroll. Begge arkene ble samtidig immundeteksjonert med anti-P-Tyr antistoff (Klon PY20 ved 1: 5000 fortynning). Som vist i Figur 1 ble flere p-Tyr-bånd detektert ved 100, 70, 45 og 35 kDa i kontrollmembranen (øverst til venstre). Disse p-Tyr-proteinene var antagelig allerede fosforylert før ekstraksjon. Inkubasjonen med MgATP etter separasjon økte Tyr-fosforylering av et protein ved 45 kDa i hjertemuskellysater (Figur 1, øverst til høyre, lane 2), noe som indikerer autofosforylering Av tyr-rester i denne kinasen på membranen etter renaturering. Figur 1 viser densitogrammer av lane 2 (- /+ MgATP). For å verifisere ekvivalent lasting av protein på de to blottene, ble filtrene utsatt For Coomassie-farging (Figur 1, bunn). Et teknisk notat er at i løpet av utviklingen av metoden fant vi at behandlingene med bufret 2-propanol OG 6M Gu-HCl begge var nødvendige for påvisning av kinaseaktiviteter. DERFOR oppdaget KAT-WB en 45-kDa Tyr kinase.

En annen versjon av KAT-WB bruker stedsspesifikk fosforylering av et substratprotein absorbert PÅ PVDF-membran i nærheten av kinasen. Vi brukte fosfatase holoenzyme inhibitor – 1 (PHI-1) som et protein av interesse, hvis fosforylering Ved Thr57 omdanner dette cellulære proteinet til en inhibitor av Type-1 Ser/Thr fosfatase . Figur 2a viser kat-WB data ved bruk som en positiv kontroll rekombinant ZIPK, En Ser/Thr kinase kjent for å fosforylere rekombinant PHI-1 Ved Thr57 . Etter denatureringen og den trinnvise renatureringsprosessen ble membranen gjennomvåt over natten ved 4°C i renatureringsbufferen supplert med rekombinant PHI – 1 villtype (WT) eller en ikke-fosforylerbar versjon (T57H) ved 0,2 mg/ml, og deretter ble fosforyleringsreaksjonen kjørt med MgATP. Fosforylert PHI-1 på membranen ble detektert ved bruk av anti-P-PHI-1 (Thr57) antistoff , og dette viste et bånd av rekombinant ZIPK. Imidlertid ble det bare oppdaget et svakt signal på kontrollmembranene uten PHI-1 eller MED t57h-versjonen AV PHI-1. Disse dataene antyder at ommettede kinaser på membranen er i stand til å fosforylere substrater som også absorberes på membranen. KAT-WB ble brukt til å oppdage FLERE PHI-1 kinaser i vev og celler (Figur 2b). Ekstrakter fra rotte skjelett, hjerte muskler og Neuro2a celler ble utsatt FOR KAT-WB assay. Sammenlignet med NO-ATP-kontroll (venstre, topp), oppstod signaler AV P-PHI-1 på blottet inkubert med 1 mM MgATP (høyre, topp). Fremtredende bånd AV P-PHI-1 ble påvist I Nevro2a-cellelysater ved 100, 60 og 49 kDa (lane 3, open arrowhead). Imidlertid var ingen bånd FOR P-PHI-1 tydelig i banen med ekstrakter av skjelett-og hjertemuskulatur (baner 1 og 2). P-PHI-1-signalet ble ikke forbedret av fosforyleringstrinnet uten PHI-1 (Figur 2, bunn, blank: BLK). Disse resultatene viser at DET er flere PHI-1-kinaser uttrykt i nevronceller, men ikke i skjelett-eller hjertemuskulatur. Dette gir oss et kraftig verktøy for å oppdage flere substratspesifikke kinaser i celler og vev. En teknisk merknad er at natten renaturering MED PHI-1 var nødvendig for påvisning av fosforylering signaler, og at en høyere konsentrasjon AV PHI-1 ikke øke fargeintensiteten (ikke vist).

Basert på disse dataene foreslår VI AT KAT-WB er i stand til å oppdage autofosforylering Av Tyr-kinaser og stedsspesifikk fosforylering av selektive substratproteiner av interesse ved flere proteinkinaser tilstede i vev og celler. KAT-WB deler i hovedsak fordeler med den tradisjonelle fosforyleringsanalysen i gel, som oppdager kinaseaktiviteter i en rå blanding, for eksempel celleekstrakter, og utsetter deres molekylære størrelser . En annen fordel med disse to analysene er at Post-translasjonelle modifikasjoner (Ptm) av kinaser i celler kan bevares på et ønsket tidspunkt under spesifikke forhold, fordi prøvene for disse analysene raskt denatureres med bufferen, inkludert SDS, eliminerer fosforylering og defosforylering i ekstraktene . De fleste proteinkinaser er regulert GJENNOM PTM. KAT-WB er i stand til å overvåke svingninger i kinaseaktiviteter, selv om regulatoriske Ptmer ennå ikke er karakterisert. KAT-WB kan ikke oppdage hver kinase i celleekstrakter fordi bare monomere enzymer som renaturerer effektivt under de anvendte forholdene, viser aktivitet. Modifikasjoner AV KAT-WB bør imidlertid kunne oppdage kinaser regulert av calmodulin og cyclins, som det har blitt gjort ved in-gel fosforyleringsanalyse . Forbedring av renatureringseffektiviteten og en kombinasjon med immunprecipitasjon / immunodepletion med antistoffer mot kinaser kan utvide nytten av tilnærmingen.

det er bemerkelsesverdig at i tillegg til fosforylering kan prinsippet OM KAT-WB-protokoll brukes til påvisning av ANDRE PTM-enzymer, som acetylaser, metylaser og ubiquitinligaser, NÅR PTM-spesifikke antistoffer er tilgjengelige. Sammen med utviklingen av antistoffer som gjenkjenner stedspesifikke Ptm, vil forskningsmål dekket av aktivitetsmerket western blotting bli utvidet.