PMC

Pseudomonas aeruginosa Er en allestedsnærværende miljøgramnegativ bakterie som finnes i jord og vann. Det er også et opportunistisk patogen som forårsaker infeksjoner hos personer med medfødte immundefekter, inkludert pasienter med cystisk fibrose (cf) (8). P. aeruginosa møter lav-oksygen miljøer i jord og vann. Bevis tyder på at hos mennesker med CF kan bakterier, i det minste delvis, være i et miljø med lavt oksygeninnhold i mucopurulente masser eller biofilmer i luftveiene (19). P. aeruginosa er i stand til å vokse anaerobt i nærvær av terminale elektronacceptorer, som nitrat (NO3 -−, nitritt (NO2 -) og nitrogenoksid (N2O), eller når l-arginin er et substrat for vekst (21). CF luftveis slim er tilstrekkelig rik PÅ NO3 – OG NO2-for å støtte den anaerobe veksten Av P. aeruginosa (7, 19). I denne studien ble det utført en sammenligning Av P. aeruginosa-proteomet under vekst i nærvær og fravær av oksygen.

S. aeruginosa stamme PAO1 hentet Fra Steve Lory (Harvard Medical School, Boston, MA) ble dyrket i 125 ml flasker I Luria buljong (LB) supplert med 1% KNO3 med risting ved 200 rpm ved 37°C For aerob vekst. Anaerob vekst ble fullført som tidligere beskrevet (9) i 80 ml medium i 100 ml Wheaton-serumflasker (Fisher Scientific) med gummipropper. Mediet ble fratatt oksygen ved å bli utsatt for boblende med n2 gass for 1 h. For både aerobe og anaerobe forhold ble bakterier høstet i den sene logaritmiske vekstfasen, hvor celletettheten (optisk tetthet ved 600 nm) av den anaerobe kulturen var 44% av tettheten av den aerobe kulturen. Det var ingen signifikant forskjell mellom pHs av høstede kulturer (pH 7,6 for anaerob kultur og pH 7,4 for aerob kultur). Like mengder denaturert og redusert helcelleprotein (2.0 mg fra hver veksttilstand) ble merket med enten lett (12c) eller tung (13C) spaltbar isotopkodet affinitetsmerke (ICAT) reagens (Applied Biosystems, Foster City, CA), behandlet og analysert som tidligere beskrevet (3). De rapporterte dataene er gjennomsnittet av minst to uavhengige eksperimenter.

Seks hundre ti p. aeruginosa proteiner ble identifisert og kvantifisert VED HJELP AV ICAT(for en fullstendig liste over proteiner, se Tabell S1 i supplerende materiale). Blant 151 proteiner hvis overflod endret seg under anaerob vekst, var 76 høyere i overflod (Tabell (Tabell 1) 1) og 75 var lavere i overflod (Tabell (Tabell 2).2). Som forventet ble 13 proteiner som deltar i anaerob vekst og denitrifisering (inkludert produkter av nir, nos og nar-gener) uttrykt ved høyere nivåer under anaerob vekst (Tabell (Tabell 1).1). Disse resultatene tyder på at de observerte endringene i proteininnholdet inkluderer de som skyldes vekst på forskjellige oksygenivåer.

endringene i det oppdagede proteomet kan også gjenspeile forskjeller i all tetthetsavhengig regulering i tillegg til effekter av oksygenspenning, gitt den lavere relative celletettheten av den høstede anaerobe kulturen. Faktisk er 29 proteiner oppdaget i lavere overflod i anaerobt dyrkede celler kodet av gener som tidligere viste seg å være quorum sensing indusert (5, 16, 17). Disse inkluderer hydrogencyanidsyntase-underenhetene HcnB og HcnC; Pseudomonas kinolon signal biosyntetiske enzymer PqsB, PqsC og PqsD; Og PhnB (Tabell (Table2).2). I samsvar med våre resultater ble hcn-og pqs-gener også funnet å være transkripsjonelt undertrykt under anaerob vekst ved en nylig DNA-mikroarray-analyse ved bruk av aerobe og anaerobe kulturer høstet ved samme celletetthet (1) (Tabell (Tabell22).

for å identifisere utskilt P. aeruginosa-proteiner med endrede nivåer under anaerob vekst ble kultur supernatante proteiner konsentrert (11) og separert av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (Sds-PAGE) (Fig. (Fig.1).1). Fire Coomassie-farget protein band, tilsvarende differensielt uttrykte proteiner, ble identifisert og analysert som i en tidligere studie (4) (Fig. (Fig.1).1). Overflodene av tre utskillede proteiner syntes å synke under anaerob vekst: CbpD-kitinbindende protein, LasB elastase og et protein med ukjent funksjon kodet AV PA0572. Tidligere proteomiske studier fant at alle tre av disse proteinene er quorum sensing indusert (11). Et protein syntes å være økt i overflod under anaerob vekst og ble identifisert som enten flagellarfilamentproteinet FliC eller flagellar capping protein FliD (på grunn av overlappingen i egenskapene til disse to proteinene).

de fleste p. aeruginosa ytre membranproteiner inneholder ikke cysteinrester og kan derfor ikke analyseres MED ICAT (4). Derfor ble todimensjonal (2D) SIDE brukt som en komplementær metode (4). Flere ytre membranproteiner (Fig. (Fig.2) 2) ble skåret ut FRA 2d gel og identifisert (4). OprE syntes å øke i overflod under anaerob vekst, Mens OprF og OprH syntes å redusere i overflod (Fig. (Fig.2).2). Alle tre proteinene migrerte som flere arter under isoelektrisk fokusering (Fig. (Fig.2).2). Redusert overflod av OprF under anaerob vekst ble bekreftet ved immunoblotting av ytre membranproteiner (data ikke vist) ved bruk av et polyklonal anti-OprF antiserum (en gave Fra Robert Hancock, University Of British Columbia I Vancouver, Canada).

Blant p. aeruginosa-proteinene som viste økt overflod under anaerob vekst (Tabell (Tabell 1; 1; Fig. Fig.1), 1), flere bidrar til funksjoner involvert i dannelse og utvikling av biofilmer. Disse proteinene inkluderer katabolitt undertrykkelse kontroll protein Crc og rykninger motilitet proteiner PilU, PilG, Og ChpA (12, 13, 18). I samsvar med et økt Nivå Av Crc i anaerobt dyrkede celler (Tabell (Tabell1),1), ble kjente mål for Crc-undertrykkelse redusert i overflod (Tabell (Tabell2), 2), inkludert hmgA-og bkd-genproduktene (6, 10). ChpA og PilG er komponenter i et komplekst reguleringssystem som kontrollerer rykningsmotilitet (18). Samlet sett tyder disse resultatene på at uttrykk eller funksjon av celleoverflatetilheng som påvirker biofilmdannelse, endres under anaerob vekst. Slike endringer kan bidra til økt biofilmdannelse observert for p. aeruginosa som vokser anaerobt (20).

I tillegg til endringene i ytre membranproteiner observert under anaerob vekst, VISTE ICAT-analyse at flere enzymer involvert I biosyntese Av P. aeruginosa lipopolysakkarid (LPS) ble uttrykt ved høyere nivåer under anaerob vekst (Tabell (Tabell 1).1). Disse inkluderte en homolog av beta-hydroksylase LpxO2, som hydroksylater lipid a-fettsyrer (14); lps kjerne heptosyltransferaser WaaC Og WaaF (2, 15); Og WbpG, som er kodet av en genklynge som deltar i syntesen av et langt b-band O-antigen. Disse resultatene tyder på AT LPS-innholdet kan endres som følge av anaerobiose.

oppsummert endres P. aeruginosa proteomet betydelig under anaerob vekst. Vi identifiserte 617 proteiner totalt: 610 VED ICAT-analyse, 4 ved sds-SIDEANALYSE og 3 ved 2d-sideanalyse. Av de 617 identifiserte proteinene varierte overflodene av 158 mellom anaerobt dyrkede og aerobisk dyrkede celler. Fordi p. aeruginosa nådde en lavere celletetthet under våre anaerobe vekstforhold enn under aerobe vekstforhold, kan tetthetsavhengige endringer i proteinuttrykk ha bidratt til proteomet som vi oppdaget under anaerob vekst. Likevel er bakteriell celletetthet sannsynligvis begrenset i mange miljønicher hvor flere næringsstoffer (inkludert oksygen) er knappe. Derfor bidrar endringene i proteinnivåer som vi har oppdaget til en forståelse av hvordan proteom og metabolsk tilstand av bakterier varierer i respons til forskjellige miljøer. Direkte analyse av bakterielt proteininnhold er en robust teknologi for å observere tilpasning av bakterier til spesifikke miljønicher, inkludert CF-luftveien.