det er avgjørende å ha kontroll over viral titer i eksperimentelt arbeid med virus. For å lette sammenligninger mellom studier utført ved forskjellige laboratorier, er bruk av harmoniserte standardmetoder ønskelig. For humant herpesvirus 6 (HHV-6), et β-herpesvirus som de fleste har vært utsatt for, brukes 50% vevskulturinfeksjonsdose (TCID50) – metoden ofte til viral titervurdering. En vanlig avlesning er okulær inspeksjon for cytopatiske effekter (CPE), dvs .utvidelse av de infiserte cellene. Et hinder med denne tilnærmingen er at celler kan forstørre selv når de ikke er smittet. Det er spesielt vanskelig på grensen av infeksjon i titrering serien’ som celler forstørret på grunn av infeksjon tendens til å forstørre mindre med økt fortynning av viruset (Tilleggsfil 1: Figur S1). Immunfluorescensanalyse (ifa) er en alternativ lesetilnærming til okulær inspeksjon I tcid50-vurdering eller for beregning av smittsomme enheter, dvs. brøkdel av infiserte celler . IFA – basert avlesning er mer tydelig i diskriminerende infisert fra uinfiserte celler, men fargingen er arbeidskrevende og et betydelig antall celler må telles for å få pålitelige verdier. Overvåking av individuelle celler innebærer en risiko for å feiltolke en celles positivitet, en ulempe ved både okulær inspeksjon og IFA-baserte avlesninger. Derfor utviklet og validerte VI en alternativ metode FOR avlesning AV TCID50 hvor økningen i viral DNA-belastning måles i hver titreringsbrønn PÅ tcid50 kulturplater ved hjelp av sanntids kvantitativ PCR (Q-PCR). Denne tilnærmingen ble sammenlignet med okulær inspeksjon og IFA-avlesninger AV TCID50, og med den smittsomme enhetstilnærmingen beskrevet ovenfor.
hhv-6a (GS stamme) ble forplantet i t-cellelinjen HSB-2 i GlutaMAX inneholdende rpmi 1640 medium (Invitrogen, Storbritannia) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyklon, UT), 100 e/ml penicillin og 100 µ/ml streptomycin (Invitrogen). Når omtrent 50% av de levende cellene hadde forstørret seg, ble supernatanten høstet og frosset umiddelbart i alikvoter ved -80°C inntil analyse. Som kontroller ble virus-supernatanten i passasje 17 (P17) inaktivert AV UV-lys i 20 minutter eller med varmebehandling ved 56°C i 1 time. Hhv-6A-replikasjon i HSB – 2-celler ble fulgt i ti dager ved BRUK AV Q-PCR (Applied Biosystems, Storbritannia) som tidligere beskrevet . FØR Q-PCR-analyse ble DNA ekstrahert fra cellesuspensjonene ved hjelp av et 96-brønnplatebasert sett i henhold til produsentens protokoll (MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit, Applied Biosystems). FOR å vurdere HHV-6A DNA-innholdet i viruspartiene ble Q-PCR utført som beskrevet ovenfor etter DNA-ekstraksjon ved hjelp av filterkolonner (QIAGEN GmbH, Tyskland).
for å sette OPP tcid50 kulturplater ble cellesuspensjoner på 40 µ 104 HSB-2 celler per brønn sådd i runde bunn 96-brønnkulturer. Cellene ble inokulert i 3-4 timer med 160 µ fem ganger fortynning AV HHV – 6a supernatant, seks replikater per fortynning. Mock og medium kontroller ble inkludert i tre eksemplarer brønner på alle plater. Cellene ble vasket en gang før 50-70 hryvnias cellesuspensjon ble samplet fra hver brønn og lagret ved -80 hryvnias C som prøver med null dag etter infeksjon (dpi). De resterende cellesuspensjonene ble inkubert i syv dager ved 37°C. Ved syv dpi ble den tintede null dpi-platen og de syv dpi-platene utsatt FOR DNA-ekstraksjon ved hjelp av det perlebaserte settet beskrevet ovenfor. Deretter ble viral DNA kvantifisert VED Q-PCR som beskrevet ovenfor.
for ifa ble cellene festet på glassglass med en 1: 1 blanding av aceton Og metanol ved -20°C i 10 minutter, blokkert med 5% geiteserum og 3% bsa i PBS, og farget med et primært monoklonalt antistoff fra mus som er spesifikt for hhv-6 glykoprotein gp116 / 54 / 64 (Advanced Biotechnologies, MD). Fargingen ble visualisert Av En Alexa 633 konjugert geit anti-mus IgG (Invitrogen). Farging med 4′, 6-diamidino-2-fenylindol (Vector laboratories, CA) ble brukt til å visualisere cellekjernene. Dekkslipsene ble montert med monteringsmedier (DAKO A / S, Danmark), og lysbildene ble analysert ved hjelp Av et konfokalt mikroskop (Leica Microsystems, Tyskland). Fraksjonen av infiserte celler ble bestemt ved manuell telling. Dersom ≥1/3 av cellene inneholdt virusprotein, ble ≥25 celler per brønn talt, og dersom < 1/3 av cellene inneholdt virusprotein, ble ≥100 celler per brønn talt. Brønner hvor ≥2% av cellene farget positive ble ansett som infiserte. Nivået av viral DNA-belastningsøkning i hver brønn var korrelert med IFA-fargingen som konstruerte en formel i Programvaren Excel (Microsoft, WA). Denne formelen spør om viralt DNA i en bestemt brønn I TCID50-platen har skiftet et visst antall ganger som er satt, og om den samme brønnen var positiv i IFA eller ikke.
for sammenligninger MED q-PCR-avlesningen ble alle tcid50-plater vurdert ved okulær inspeksjon ved hjelp av et fasekontrastmikroskop av to uavhengige inspektører (okulær TCID50). Brønner ble ansett som infiserte hvis minst en forstørret celle ble funnet. FOR begge avlesningsmetoder ble TCID50 beregnet i henhold til Reed og Muench-formelen .
tcid50-resultatene bestemt AV Q-PCR (Q-PCR TCID50) ble sammenlignet med infektiøse enheter vurdering av Ifa (personlig kommunikasjon Med Louis Flamand) på tre tidspunkter For P19 og en For P27. Kort sagt ble 2,5 * 105 hsb-2-celler inokulert som beskrevet ovenfor med forskjellige fortynninger av virus i triplikatbrønner for hver fortynning. Ved to dpi ble cellene utsatt FOR IFA rettet mot det tidlige virusproteinet p41 (klon 9A5D12, Santa Cruz Biotech. Inc., CA) som beskrevet ovenfor. Viral titer, uttrykt som smittsomme enheter per ml ble beregnet ved å multiplisere fraksjonen av infiserte celler med totalt antall celler ved null dpi og fortynningsfaktorer.
for å bestemme det optimale tidspunktet for målinger av viral DNA-belastning ble virusreplikasjon fulgt i ti dager. Syv dager var nødvendig for å oppnå tilstrekkelig økning i viralt DNA (Figur 1) og ble derfor valgt som høsttidspunkt. For å angi kuttpunktet for relativ viral DNA-økning som tilsvarer positiv infeksjon, var den virale DNA-belastningsøkningen korrelert med virusproteinuttrykk. IFA ble utført på syv dpi på celler fra hver brønn i tre tcid50 plater for to forskjellige viruspartier. Det optimale kuttpunktet ble funnet å være en ti ganger økning i viralt DNA, hvor korrelasjonen til proteinuttrykk ble sett i 93% av brønnene (Figur 2).
Replikering AV HHV-6A (GS stamme) etterfulgt AV Q-PCR. De viste dataene er gjennomsnittlige resultater (± SEM) for triplikatkulturer for hver multiplikasjon av infeksjon (MOI). Forbindelseslinjer avsluttes når viral DNA-belastning falt under deteksjonsgrensen.
Bestemmelse av kuttpunkt for infeksjon. Det optimale kuttpunktet for infeksjon ble funnet å være en ti ganger økning hvor korrelasjonen til proteinuttrykk ble sett i 93% av brønnene av IFA med et antistoff rettet mot det sene virusproteinet gp116/54 / 64. Ingen godt inneholdt virusprotein hvor den virale DNA-belastningen ikke hadde økt ti ganger. De viste dataene er gjennomsnittlige resultater (± SEM) fra tre tcid50-plater.
Ved Å Sammenligne verdiene AV Q-PCR TCID50 med okulær OG IFA TCID50, utgjorde EN Q-PCR TCID50 1,41 okulær OG 1,03 IFA TCID50 basert på henholdsvis 13 eller 5 vurderinger. Q-PCR TCID50 ga ikke statistisk forskjellige verdier sammenlignet med okulær ELLER ifa TCID50 (henholdsvis p = 0,41 eller p = 0,29) (paret t-test) (Tabell 1).
Viral DNA kopi tall blir ofte brukt som et grovt estimat av mengden av virale partikler en bestemt viral batch inneholder. Det er imidlertid usikkert hvor godt dette tilsvarer smittsomhet. FOR å vurdere DETTE ble tcid50-verdier sammenlignet med de virale DNA-kopieringsnumrene for den respektive batchen. Gjennomsnittlig ratio av viral DNA-belastning til Q-PCR TCID50-verdier i viruspartiene var lik For P17 Og P19; 6,3 * 105 og 2,0 * 106 virale DNA-kopier per HENHOLDSVIS tcid50. For P21 var imidlertid forholdet betydelig høyere, 1,3 * 108 virale DNA-kopier per TCID50 (Tabell 1). Dermed er måling av viralt DNA i batchs supernatanter utilstrekkelig til å korrekt tildele smittsomheten til en batch, og derfor bør biologiske analyser utføres for å nøyaktig bestemme virale titere.
GJENNOMSNITTLIG intra-analyse variasjonskoeffisient (CV) FOR Q-PCR TCID50 var 9%, bestemt av parallelle dupliserte ekstraksjoner og Q-Pcr av tre tcid50 kulturplater. FOR okulær TCID50 var INTRA-assay CV 45%, bestemt av totalt tolv tcid50 kulturplater lest av to uavhengige bedømmere. INTRA-assay CV var 14% for IFA TCID50 bestemt ved to parallelle farging av celler fra to løp. For smittsomme enheter tilnærming intra-assay CV var 43% bestemt av fire parallelle farging av celler fra ett løp. GJENNOMSNITTLIG inter-assay CV var 73% FOR Q-PCR TCID50 og 66% for okulær TCID50, bestemt for henholdsvis tre viruspartier fem, tre og tre ganger. For IFA TCID50 var inter-assay CV 25%, bestemt for en batchkjøring tre ganger. For smittsomme enheter tilnærming inter-assay CV var 77%, bestemt av tre separate løp for en batch.
oppsummert korrelerer q-PCR TCID50-metoden beskrevet her godt med ekspresjon av virale proteiner og har dermed høy spesifisitet for infeksiøs dose. Det er mer robust enn okulær TCID50, IFA TCID50 og infeksiøse enheter tilnærming, basert på intra-assay CV verdier. INTRA-assay CV er i denne innstillingen et mål på hvor presis en bestemt avlesningstilnærming er, og er derfor den mest nøyaktige verdien for sammenligninger av de ulike metodene. For å tilpasse metoden må kuttpunktet bestemmes for hver virusstamme som testes og hver cellelinje som brukes. Q-PCR-avlesningsmetoden er mer arbeidskrevende enn okulær inspeksjon, men etter vår mening betydelig mindre arbeidskrevende enn IFA TCID50 og smittsomme enheter tilnærming. Det er dyrere når det gjelder laboratorieressurser enn okulær inspeksjon, IFA TCID50 og smittsomme enheter tilnærming. Imidlertid understreker våre data viktigheten av å utføre biologiske analyser for å nøyaktig bestemme virale titere, noe som kan garantere kostnadene og arbeidskraften. Videre kan bedre standardisering av virale titer vurderingsmetoder som brukes I HHV – 6-feltet øke konkordansen mellom ulike studier.