de gelelektroforese van DNA is een techniek die wordt gebruikt om DNA-fragmenten te scheiden en te identificeren op basis van grootte.
DNA-fragmenten van verschillende grootte worden geladen in een poreuze gel gemaakt van agarose – een koolhydraat dat voorkomt in rode algen.
wanneer een elektrisch veld wordt toegepast, zullen de fragmenten door de gel migreren, dankzij de negatief geladen fosfaatgroepen in DNA-nucleotiden.
kleinere stukjes DNA zullen gemakkelijker door de gel migreren dan grotere fragmenten, die moeilijker door de gelmatrix kunnen bewegen.
wanneer de gel run is voltooid, kan de locatie van uw DNA-monsters worden vergeleken met een reeks fragmenten of banden van bekende grootte, een zogenaamde DNA-ladder.
de aanwezigheid van uw fragment van belang kan dan worden bevestigd op basis van de grootte, die wordt bepaald door de relatieve locatie van uw testmonster te vergelijken met de fragmenten van de ladder.
Agarose-gels worden bereid met een oplossing in verhouding tot het volume. Dus 1 gram agarose in 100 ml buffer zal een 1% gel maken. Het lagere percentage gels zal grotere fragmenten beter oplossen en het hogere percentage gels zal kleinere fragmenten gemakkelijker te identificeren maken. Om de gelproductie te starten, wordt de juiste massa agarose in een erlenmeyer afgewogen.
voeg een buffer aan de kolf toe, zodat het buffervolume niet groter is dan 1/3 van de capaciteit van de kolf. Draai dan om te mengen.
smelt het agarose/buffermengsel door verhitting in een magnetron op maximaal vermogen. Om de dertig seconden de kolf verwijderen en de inhoud draaien om goed te mengen. Herhaal dit totdat de agarose volledig is opgelost.
voeg vervolgens ethidiumbromide toe aan een concentratie van 0,5 mg/ml. Ethidiumbromide is een aromatische verbinding die tussen individuele basenparen van DNA, of intercalaten past, en ervoor zorgt dat DNA intense oranje fluorescentie onder UV-licht uitzendt. Het is belangrijk op te merken dat ethidiumbromide een kankerverwekkende stof is, zodat handschoenen altijd moeten worden gedragen bij het hanteren van gels die deze verbinding bevatten.
om kromtrekken van de gelbak te voorkomen, laat de agarose afkoelen door deze in een waterbad van 65 ° C te plaatsen.
terwijl de agarose afkoelt, bereidt u de gelvorm voor door de gelbak in het gietapparaat te plaatsen. Als alternatief kunt u tape gebruiken om de open randen van de gellade af te dichten om de mal te maken. Het plaatsen van een kam in de gel creëert de putten waar DNA wordt geladen. Zorg ervoor dat de kam een put creëert die de juiste grootte heeft voor uw DNA-monster.
giet de gesmolten agarose in de gelvorm en laat deze bij kamertemperatuur uitharden.
nadat de agarose is uitgehard, de kam verwijderen. Als de gel niet onmiddellijk wordt gebruikt, wikkel deze dan in een plastic omhulsel en bewaar bij 4ºC tot gebruik.
als de gel onmiddellijk wordt gebruikt, plaats deze dan in de geldoos.
om deze procedure te starten, moet de gelladende kleurstof aan de te scheiden DNA-monsters worden toegevoegd. Het laden van kleurstof wordt typisch gemaakt bij een concentratie van 6X. De ladingskleurstof helpt om steekproeven in de putten te visualiseren en te laden en helpt bepalen hoe ver de steekproeven tijdens de looppas zijn gemigreerd.
Stel de voeding in op de gewenste spanning.
Voeg nu voldoende actieve buffer toe aan de gelbox om het oppervlak van de gel te bedekken. Zorg ervoor dat u dezelfde hardloopbuffer gebruikt als die gebruikt is om de gel voor te bereiden.
sluit de aansluitsnoeren van de gelbox aan op de voeding en zet deze aan. Onthoud dat DNA negatief geladen is en zich naar de anode zal bewegen, die positief is, en over het algemeen rood van kleur. Zorg ervoor dat u de zwarte draad of kathode niet aan de onderkant van de geldoos sluit. Dus vergeet niet, houd in gedachten dat zwarte katten pech hebben, of negatief, en de zwarte kathode is dus negatief. Breng je gel naar rood, of de anode. Om te controleren of zowel de geldoos als de voeding werken; het verschijnen van bellen bij de elektroden geeft aan dat de stroom door gaat.
verwijder het deksel van de geldoos. Laad langzaam en zorgvuldig de DNA-monsters in het gel. Opnieuw, staat de ladingskleurstof in de steekproef de steekproef toe om in het gel te zinken en zal helpen om te volgen hoe ver de Steekproef heeft gereisd. Een teller van de DNA-grootte, of ladder, zou altijd samen met de experimentele steekproeven moeten worden geladen.
deksel vervangen. Controleer nog eens of de elektroden zijn aangesloten op de juiste sleuven in de voeding.
zet de stroom aan. Laat de gel lopen totdat de kleurstof is gemigreerd naar een geschikte afstand.
wanneer de elektroforese is voltooid, zet de voeding uit en verwijder het deksel van de gelbox.
verwijder de gel uit de gelbox en laat de overtollige buffer uitlekken op het oppervlak van de gel. Plaats de gellade op papieren handdoeken om eventuele resterende lopende buffer te absorberen.
om de DNA-fragmenten te visualiseren, verwijdert u de gel uit de gelbak en stelt u de gel bloot aan ultraviolet licht.
DNA-fragment moet zichtbaar zijn als oranje fluorescerende banden. Neem een foto van de gel.
aan het einde van het experiment moet de gel en de lopende buffer naar behoren worden verwijderd volgens de voorschriften van de instelling. Nogmaals, vergeet niet om de gel en lopende buffers altijd met handschoenen te behandelen om blootstelling aan ethidiumbromide te voorkomen.
Nu u hebt gezien hoe u DNA-gelelektroforese kunt uitvoeren. Laten we eens kijken naar een aantal downstream toepassingen en variaties van deze zeer nuttige methode.
hier ziet u een agarose gel elektroforese resultaat na het scheiden van PCR producten. De fragmenten van DNA die in het gel worden geladen zijn zichtbaar als duidelijk gedefinieerde banden. De standaard of de ladder van DNA zou in een mate moeten worden gescheiden die voor de nuttige bepaling van de grootte van steekproefbanden toestaat. In dit voorbeeld, worden de fragmenten van DNA van 765 basisparen, 880 basisparen EN 1022 basisparen gescheiden op een 1,5% agarose-gel met een ladder van 2 log DNA.
naast het bevestigen van de aanwezigheid van een DNA-fragment van belang, kan DNA-gelelektroforese worden gecombineerd met gelzuiveringsprocedures. Typisch wordt een scheermesje gebruikt om het fragment van DNA van belang uit te snijden, zodat het kan worden verzameld en de DNA-steekproef binnen het teruggekregen.
Agarosegelelektrofese kan ook worden gecombineerd met overdrachtsblotting, waarbij DNA of RNA kan worden overgedragen naar een cellulosemembraan waar radioactieve sondes kunnen worden gebruikt om specifieke DNA-of RNA-sequenties in uw elektroforetisch gescheiden monster te identificeren.
standaard – DNA-gelelektroforese is niet ideaal voor de scheiding van DNA met een hoog molecuulgewicht groter dan 15-20 kb, zoals genomisch DNA. Om grote steekproeven van DNA te scheiden, wordt het gelelektroforese van het impulsveld gebruikt, wat het onderwerpen van het gel aan een veranderend, of pulserend, elektrisch gebied in verschillende richtingen impliceert. Deze techniek impliceert een gespecialiseerd gel lopende apparaat, dat paren elektroden heeft die in verschillende oriëntaties rond het gel worden opgesteld. Dit kan worden gebruikt om verschillen in genoomgrootte tussen populaties van organismen te detecteren, zoals de gepoolde DNA-monsters van verschillende microbiële gemeenschappen, die je hier ziet, die uit verschillende meeromgevingen worden genomen.
u hebt zojuist een introductie gezien van DNA-gelelektroforese. We lieten u het concept achter de methode zien, hoe u de agarose-gel moet voorbereiden, hoe u uw monsters moet laden, hoe u de gel moet uitvoeren en analyseren en enkele veel voorkomende toepassingen van agarose-gelelektroforese. Bedankt voor het kijken en veel geluk met het uitvoeren van uw gel.