hemoglobine affiniteit voor zuurstof in drie ondersoorten padden (Bufo sp. en woon op verschillende hoogtes
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 Clinicum Laboratorio Automatizado, Iquique, Chili
2 Laboratorio de Transporte de Oxígeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Chili
ABSTRACTE
Bloed zuurstof affiniteit en rode bloedcellen eigenschappen werden gemeten in drie ondersoorten van het geslacht Bufo: Bufo spinulosus limensis, verzameld op zee-niveau en op een gemiddelde dag temperatuur van 20ºC; Bufo spinulosus trifolium, van 3100 m, gemiddelde dagtemperatuur van 15ºC; en Bufo spinulosus flavolineatus, van 4100 m, gemiddelde dagtemperatuur van 10ºC. Elektroforese van de hemoglobine toonde dezelfde component in elk van de drie ondersoorten. Bij 20ºC vertoonden de bloedzuurstofverwantschappen (P50) kleine verschillen tussen Bufo spinulosus limensis en Bufo spinulosus trifolium, terwijl de waarde voor Bufo spinulosus flavolineatus duidelijk lager was. Bij 10ºC, de omgevingstemperatuur van Bufo spinulosus flavolineatus, was de P50 extreem laag in vergelijking met de andere twee ondersoorten bij hun overeenkomstige omgevingstemperatuur.
sleutelwoorden: adaptations, altitude, amfibians, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, hemoglobine affiniteit, hematocrits, zuurstofbinding, padden
inleiding
in Peru heeft het geslacht Bufo een hoogtegradiënt variërend van zeeniveau tot boven 4000 m. De soort Bufo spinulosus heeft drie ondersoorten waarvan de niches op lage, middelhoge en grote hoogten zijn. Deze ondersoorten zijn Bufo spinulosus limensis (lage hoogte), Bufo spinulosus trifolium (gemiddelde hoogte) en Bufo spinulosus flavolineatus (grote hoogte) (12). Een van de meest intensief bestudeerde milieuadaptaties van het ademhalingssysteem in gewervelde dieren is die van hypoxie, die verschillend op grote hoogte, in embryonale ontwikkeling (b.v., in utero) en in aquatische, in het bijzonder zoet water, milieu ‘ s voorkomt. Deze aanpassingen impliceren gewoonlijk veranderingen in de eigenschappen van de rode cellen, in de zuurstof-dragende capaciteit, of in de zuurstof affiniteit van de hemoglobine. Intraspecifieke aanpassingen, die in hetzelfde dier onder verschillende omstandigheden voorkomen, impliceren over het algemeen veranderingen in allosterische factoren (d.w.z., de voorwaarden waaronder de hemoglobine functies binnen de rode cellen), terwijl interspecifieke aanpassingen, die duidelijk zijn bij het vergelijken van verschillende soorten, zijn toe te schrijven aan veranderingen in de eigenschappen van de hemoglobine moleculen.
de meeste studies naar hypoxische aanpassingen in eigenschappen van rode bloedcellen en hemoglobine hebben betrekking op vissen en zoogdieren, en er is zeer weinig bekend over lagere ectothermische gewervelde dieren. Een eerdere studie toonde aan dat de Titicacakikker Telmatobius culeus (2) die op 3800 m. leeft, een hogere bloed-O2-affiniteit had en kleinere bloedcellen dan kikkers op zeeniveau. Deze studie beschrijft de aanpassingen in Bufo-ondersoorten.
materiaal en methoden
Anuranen van de ondersoort Bufo spinulosus limensis werden verzameld op de kustvlakten op ongeveer 400 km van ons laboratorium in Lima (zeeniveau, gemiddelde dagtemperatuur 20ºC). Bufo spinulosus trifolium werd verzameld in de centrale Peruaanse Andes (ongeveer 3100 m, gemiddelde dagtemperatuur 15ºC), en Bufo spinulosus flavolineatus ook in de centrale Andes (op 4100 m, gemiddelde dagtemperatuur 10ºC). De dieren werden binnen een paar uur naar ons laboratorium gebracht. Bloed werd in heparinized spuiten getrokken uit de harten van eerder gevulde dieren. Ongeveer 3 ml bloed kon worden verkregen uit Bufo spinulosus limensis en 1 tot 1,5 ml uit de andere ondersoorten. Bloed van twee tot drie dieren werd samengevoegd om de bepalingen uit te voeren. Het aantal rode bloedcellen, de hemoglobineconcentratie en de hematocrieten werden gemeten met conventionele technieken.
elektroforese van het hemoglobine werd uitgevoerd op celluloseacetaat strips in een buffer specifiek voor hemoglobine elektroforese, en de banden werden gekleurd met Ponceau S en gelezen in een densitometer volgens de Helena Laboratories (USA) instruction manual.
de bloedzuurstofaffiniteit (P50) werd gemeten met de mengtechniek (1,10) bij 10ºC, 15ºC en 20ºC. De bloedbalans werd uitgevoerd in een tonometer die op deze temperatuur werd gehouden met behulp van gasmengsels met 4,5% CO2 en variabele O2-en N2-concentraties. De O2-verzadiging in het bloed varieerde tussen 30 en 80%. De pH-meter werd gekalibreerd met behulp van zeer nauwkeurige fosfaatbuffers.
de pH-waarden bij evenwichtstemperaturen (eq) werden berekend uit die bij meettemperaturen (meas) met behulp van de vergelijking van Rosenthal (8):
pHeq = pH meas + 0,0147 (teq _ Tmeas)
de Bohr-factor werd verkregen door de pH van het bloed als volgt te wijzigen. Plasma bereid uit bloed aliquots werd ofwel aangezuurd met melkzuur of alkaliniseerd met natriumhydroxide en gereconstitueerd met de overeenkomstige rode bloedcellen. De bloedmonsters van Bufo spinulosus limensis en Bufo spinulosus trifolium werden in evenwicht gebracht bij 20ºC en 15ºC en het bloed van Bufo spinulosus flavolineatus bij 20ºC en 10ºC en bij verschillende pH-waarden om de Bohr-factor voor elke temperatuur te berekenen (14). Deze factor maakte de berekening van de standaard pH van het bloed bij de drie temperaturen mogelijk. Om de coëfficiënt van de heuvel (n) te berekenen, werd een methode van opeenvolgende benaderingen gebruikt (10). Een waarde uit de Bohr-vergelijking voor elke ondersoort werd berekend uit gegevens in afzonderlijke experimenten.
de Van ’t Hoff-vergelijking werd gebruikt om de totale warmte van de oxygenatie DH’ uit de P50-waarden te berekenen. Voor Bufo spinulosus limensis werden waarden bij 20ºC en 15ºC gebruikt waarbij 20ºC als omgevingstemperatuur werd gebruikt. Voor Bufo spinulosus trifolium werden de waarden bij 15ºC en 20ºC gebruikt, waarbij 15ºC als omgevingstemperatuur werd gebruikt. Voor Bufo spinulosus flavolineatus werden de waarden bij 10ºC en 20ºC gebruikt, waarbij 10ºC als omgevingstemperatuur werd gebruikt. De statistische significantie werd bepaald door Student T test met software Systat 6.0 Voor Windows.
resultaten
tabellen I en II geven een samenvatting van de hematologische gegevens. Er is geen statistisch verschil tussen de waarden van Bufo spinulosus limensis en Bufo spinulosus trifolium. De waarden van het hematocriet, hemoglobine, en de hoeveelheid RBC in Bufo spinulosus flavolineatus zijn veel lager.
de elektroforese experimenten toonden dezelfde migratieafstanden in de hemoglobinen van elk van de drie ondersoorten en de aanwezigheid van twee banden in sommige van de runs (Fig. 4). Er werden geen verdere studies uitgevoerd om de hemoglobineeigenschappen te bepalen.
tabel II toont de functionele eigenschappen van het hemoglobine in het bloed, waarbij kleine verschillen in de P50 tussen Bufo spinulosus limensis en Bufo spinulosus trifolium zichtbaar zijn, terwijl de waarde voor Bufo spinulosus flavolineatus lager is. De waarden bij de omgevingstemperatuur waar de dieren werden verzameld, verschilden niet significant tussen Bufo spinulosus limensis en Bufo spinulosus trifolium. Bij Bufo spinulosus flavolineatus is de P50-waarde bij 10ºC zeer laag. Figuur 1 toont een grafiek van log P50 vs. pH. Figuur 2 toont hemoglobine zuurstof dissociatie krommen geconstrueerd met de waarden van P50 en Hill ‘ s coëfficiënt bij 20º C. De krommen voor Bufo spinulosus limensis en Bufo spinulosus trifolium zijn zeer dicht bij elkaar, terwijl die voor de Bufo spinulosus flavolineatus naar links is verschoven. Figuur 3 is een grafiek van het O2-gehalte in het bloed Versus PO2 in het bloed bij de omgevingstemperatuur van elke ondersoort. Dit toont het lage O2-gehalte en zeer lage P50 van Bufo spinulosus flavolineatus en een matige verplaatsing naar links van Bufo spinulosus trifolium in vergelijking met Bufo spinulosus limensis zonder vermindering van het O2-gehalte in het bloed in Bufo spinulosus limensis en Bufo spinulosus trifolium.
Fig. 1: Bohr effect in drie ondersoorten van Bufo spinulosus. Bufo spinulosus flavolineatus toont de grootste Bohr-factor.
Fig. 2: bloedverwantschapscurve voor de drie ondersoorten bij pH van 7,84 en 20º C. De Kromme van de Bufo spinulosus flavolineatus is naar links verschoven.
Fig. 3: hemoglobine O2 gehalte vs partiële zuurstofdruk voor elke subspeceis bij de respectieve ecologische temperatuur. Bufo Spinulosus limensis (20º C), Bufo spinulosus trifolium (15º C)Bufo spinulosus flavolineatus (10º C). Het hemoglobinegehalte van Bufo spinulosus flavolineatus is lager dan bij de twee andere ondersoorten en de P50 is erg laag.
Fig. 4: elektroforese van de drie ondersoorten van Bufo Spinulosus. Het experiment toont dezelfde migraties afstanden in de hemoglobinen van elk van de drie ondersoorten en de aanwezigheid van twee banden in sommige van de runs.
deze resultaten tonen aan dat Bufo spinulosus flavolineatus, met een natuurlijke habitat van bijna 4000 m en een gemiddelde omgevingstemperatuur van 10ºC, bij 20ºC een laag hemoglobinegehalte en een hoge hemoglobineaffiniteit heeft in vergelijking met Bufo spinulosus trifolium, met een gemiddelde omgevingstemperatuur van ongeveer 3000 m en een gemiddelde omgevingstemperatuur van 15ºC. Bufo spinulosus limensis (zeeniveau) en Bufo spinulosus trifolium hadden vrijwel identieke rondingen. Als de krommen werden verkregen bij de omgevingstemperaturen, vertoonde de Bufo spinulosus flavolineatus een zeer laag O2-gehalte en een hoge hemoglobine-affiniteit in vergelijking met de andere twee ondersoorten. In Bufo spinulosus flavolineatus wijst de hoge DH’ op een hoge gevoeligheid van de hemoglobine-affiniteit voor veranderingen in omgevingstemperatuur, en de hoge Bohr-factor wijst ook op een hoge gevoeligheid van hemoglobine-affiniteit voor veranderingen in de pH van het bloed.
discussie
het geslacht Bufo is wijdverspreid in de Andes-landen. Bufo spinulosus heeft drie ondersoorten waarvan de nissen zich bevinden in de lagere andeshellingen, de tussenliggende valleien (3000 m) en de hoogste vlakten (boven 4000 m). De middelhoge ondersoort Bufo spinulosus trifolium en de zeespiegelondersoort Bufo spinulosus limensis verschillen niet in hun hematologische waarden. De hoge Bufo spinulosus flavolineatus heeft een veel lagere hemoglobine concentratie, maar de rode cellen kenmerken zijn vergelijkbaar met de andere twee ondersoorten. De RBCs lijken kleiner te zijn dan die van de andere twee ondersoorten, in tegenstelling tot Ruiz ‘ bevindingen (9), die het tegenovergestelde aangaven. Het is bekend dat het geslacht Bufo een hogere hemoglobineconcentratie heeft dan andere amfibieën. Hutchinson en Szarki (3) schrijven dit toe aan de hoge vascularisatie en aardse gewoonte. Bufo spinulosus flavolineatus heeft echter een zeer lage hemoglobineconcentratie.
in de drie groepen toont de studie van de hemoglobine elektroforetische individuen met een elektroforetisch patroon dat twee duidelijk gescheiden hemoglobinebanden vertoont. Er is geen verschil in de hemoglobine affiniteit tussen Bufo spinulosus trifolium en Bufo spinulosus limensis bij 20ºC, terwijl die bij de Bufo spinulosus flavolineatus hoger is. Toen de verwantschappen werden bestudeerd bij de omgevingstemperaturen waar de dieren leven, had Bufo spinulosus trifolium zuurstof-dissociatiecurven die matig naar links van Bufo spinulosus limensis verschoven, en Bufo spinulosus flavolineatus toonde een zeer duidelijke verschuiving, wat wijst op een zeer hoge hemoglobine affiniteit. Inheemse zoogdieren en vogels op grote hoogte hebben meestal een hoge bloedzuurstof affiniteit en vertonen geen polycythemie op grote hoogte (5). Het zou interessant zijn om te zien of deze reacties op omgevingshypoxie en koude omstandigheden aanwezig zijn in ectotherme dieren. In theorie, zouden de koude voorwaarden moeten helpen om de tolerantie aan grote hoogte te verhogen omdat het het metabolische tarief vermindert. In het geval van Bufo spinulosus flavolineatus, waarvan de dagtemperatuur onder rotsen op 4100 m ongeveer 10ºC is en ongeveer 6ºC of minder ‘ s nachts in de vijvers waar ze half ondergedompeld rusten, wijst de hoge affiniteit op selectiedruk naar hypoxie ondanks een mogelijke vermindering van de stofwisseling. Packard en Stiverson (7) vonden geen verband tussen hoogte en hemoglobineconcentratie in de Koorkikker (Pseudacris triseriata), maar het hoogtebereik in hun studie (1500 m en 3000 m) was klein.
de hemoglobine-affiniteit is een genetisch kenmerk dat blijkbaar is geselecteerd door de hypoxische omgeving bij gewervelde dieren. Bij zoogdieren en vogels is de affiniteit een vrij vaste eigenschap die niet toeneemt in hypoxie en niet verdwijnt in normoxie (6). Bij vissen daarentegen neemt de zuurstof in het bloed aanzienlijk toe onder hypoxie (13).
uit een vergelijkend oogpunt zijn er enkele overeenkomsten tussen ectothermen en endothermen. Er is vastgesteld dat er enige correlatie is tussen hemoglobine affiniteit en hoogte bij ondersoorten van muizen die een hoogtegradiënt bezetten (11). Men heeft ook aangetoond dat binnen dezelfde zoogdierspecies die langs een verticale gradiënt in de Andes leven, individuen die in de hoogste waaier leven hemoglobines met hogere affiniteit hebben dan individuen die in de laagste waaier leven. Deze verschillen waren groter in het geval van de Andesvos, waar twee afzonderlijke soorten de twee uitersten van het hoogtegrens bezetten (4).
dit werk versterkt het concept dat polycythemie niet wordt geselecteerd als een adaptieve parameter voor de hypoxische omgeving. In tegendeel, hoge-affiniteit hemoglobine lijkt sterk te worden geselecteerd in een verscheidenheid van dieren die op grote hoogte leven.
dankbetuigingen
Wij danken Dr. Roy E. Weber voor zijn hulp bij het verduidelijken van ons denken over dit onderwerp en voor het herzien van het manuscript. Correspondent: Hrvoj Ostojic P. – Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chili. Tel. (56-57) 420599, Fax (56-57) 427683, e-mail: [email protected]
ontvangen: 13 augustus 1999. Aanvaard in herziene vorm: 6 mei 2000
bibliografie
1. EDWARD MJ, MARTIN RJ (1966). Meng techniek voor het zuurstof-hemoglobine evenwicht en Bohr effect. J Appl Physiol 21:1898-1902
2. HUTCHINSON VH, HAINES HB, ENGEBRETSON G (1976) Aquatic life at high altitude: Respiratory adaptations in the Lake Titicaca frog, Telmatobius culeus. Respir Physiol 2: 115-119.
3. HUTCHINSON VH, SZARSKI H (1965) aantal erytrocyten in sommige amfibieën en reptielen. Copeia: 373-375
4. LEON-VELARDE F, de MUIZON C, PALACIOS JA, CLARK D, MONGE-C C (1996) hemoglobine affiniteit en structuur in high-altitude and sea-level carnivores from Peru. Comp Biochem Physiol 113A:407-411
5. MCCUTCHEON FH HALL FG (1937) hemoglobine in de amfibie. J Cel & Comp Fysiol 9:191-197
6. MONGE C, LEON-VELARDE F (1991) fysiologische aanpassing aan grote hoogte: zuurstoftransport in zoogdieren en vogels. Physiol Rev 71: 1135-1172
7. PACKARD G C STIVERSON RK (1976) bloed hemoglobine concentratie bij koorkikker (Pseudacris triseriata): relatie tot lichaamsgrootte en hoogte. Am Midl Nat 96: 482-487
8. ROSENTHAL TB (1948) het effect van temperatuur op de pH van bloed en plasma in vitro. J Biol Chem 173:25-30
9. RUIZ G, ROSENMANN M, VELOSO A. (1989) Altitudinal distribution and blood values in the toad, Bufo spinulosus Wiegmann. Comp Biochem Physiol 94A: 643-646
10. SCHEID P, MEYER M (1978) Mixing technique for study of oxygen-hemoglobine equilibrium: a critical evaluation. J Appl Physiol 45: 818-822
11. SNYDER GK, BLACK CP, BIRCHARD GF (1982) ontwikkeling en metabolisme tijdens hypoxie in embryo ‘ s van grote hoogte anser indicus versus zeeniveau Branta canadensis ganzen. Physiol Zool 55:113-123
12. VELLARD J (1959) Estudios sobre batracios andinos V: el género Bufo. Mem Hist Nat Javier Prado Nº 8
13. WEBER RE (1992) Molecular strategies in the adaptations of vertebrate hemoglobine function in: WOOD SC, WEBER RE, HARGENS AR, MILLARD RW (eds) Physiol adaptations in vertebrates, New York: Marcel Dekker
14. WINSLOW RM, MORRISSEY JM, BERGER RL, SMITH PD, GIBSON CC (1978) Variability of oxygen affinity of normal blood: an automated method of measurement. J Appl Physiol: Respirat Environ Exercise Physiol 45 (2): 289-297