materialen en methoden
Duplex DNA-voorbereiding. Om de 30-BP duplexdna molecules te maken, werden twee oligonucleotides met de volgende opeenvolging en wijzigingen gekruist (geïntegreerde de Technologieën van DNA, Coralville, IA). Oligonucleotide 5′-GGGTATGGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ werd geëtiketteerd met Cy5 bij zijn 5′ eind en met Cy3 bij zijn 3 ‘ eind. Het complementaire oligonucleotide werd geëtiketteerd met biotine aan beide uiteinden.
eiwitexpressie en-zuivering. Het gele fluorescente eiwit (YFP) gen in het p2bac/pFastBac-YFP-M5-cam plasmide (een gift van H. Lee Sweeney, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia) werd geschrapt door PCR. De resulterende p2bac / pFastBac-M5-CaM plasmide codes voor kip myosine V dat is afgekapt op Glu-1099. Een leucine ritssluiting volgde de inheemse opgerolde spoel om dimerisatie te verzekeren. Om zuivering te vergemakkelijken, werd de proteã ne myosin V-terminally geëtiketteerd met een vlag-markering (DYKDDDDK). Twee recombinante baculovirussen werden gegenereerd voor eiwitexpressie in Sf9-cellen. Een codeerde de afgeknotte myosine V en de Drosophila melanogaster calmoduline afgeleid van de p2bac/pFastBac-M5-CaM plasmide. Het tweede virus codeerde de menselijke essentiële lichtketen afgeleid van het p2bac / pFastBac-ELC plasmide. Beide virussen werden gebruikt voor co-infectie van Sf9-cellen. Het eiwit werd uitgedrukt en gezuiverd zoals beschreven door Sweeney et al. (20).
Calmoduline etikettering en uitwisseling. Calmoduline werd uitgedrukt en gelabeld met Cy3 of Cy5 als volgt: een enkele cysteïne werd geïntroduceerd in zee-egel calmoduline door middel van de mutatie Q143C. Deze calmoduline werd uitgedrukt in Escherichia coli en gezuiverd zoals beschreven in ref. 21. De calmoduline werd geëtiketteerd met Cy3-maleimide of Cy5-maleimide (Amersham Biosciences) voorraadoplossingen (in DMSO) bij een 1,4-voudige molaire verhouding gedurende 20 min. Overtollige kleurstof werd verwijderd door gelfiltratie in uitwisselingsbuffer (hieronder), gevolgd door hydrofobe absorptie gedurende de nacht op BioBeads (Bio-Rad). De opname van het etiket was 102% voor Cy3-calmoduline en 75% voor Cy5-calmoduline. Aliquots werden opgeslagen bij -80°C.
de uitwisseling van geëtiketteerde calmoduline op myosine V werd uitgevoerd zoals beschreven, maar met enkele wijzigingen (22). Myosine V (150 nM) werd geïncubeerd met 0,7 nM CY3-geëtiketteerd calmoduline en 0,8 nM Cy5-geëtiketteerd calmoduline in ruilbuffer (25 mM KCL/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) bij 22°C gedurende 2 minuten. Voor de uitwisseling van calmodulinen werd 0,9 mM CaCl2 toegevoegd en het mengsel werd gedurende 5 minuten bij 22°C geïncubeerd. De reactie werd gedoofd met 7 mM EGTA. Het reactiemengsel werd aangebracht op een 100k MWCO Nanocep ultrafiltratieapparaat (Pall) en driemaal gewassen met gelijke hoeveelheden AB (hieronder) om myosine V te zuiveren van overtollig calmoduline.
Voorbereiding Van Stroomcellen. De stroomcel werd geconstrueerd met een glazen microscoopglaasje en sterk brekende coverslips gemaakt van NLAF21 (va Optical Labs, San Anselmo, CA) die bij elkaar gehouden werden door stukken dubbelzijdig Scotch tape.
voor de myosine V-experimenten werd 15 µl biotine-BSA (1 mg·ml-1) gedurende 2 minuten geïncubeerd in de stroomcel, waarna 30 µl AB-buffer (25 mM KCL/25 mM imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg·ml-1 BSA) door de stroomcel werd geleid om deze uit te spoelen. Vijftien microliters van 0,5 mg/ml Neutravidine (moleculaire Probes) werden aan de cel toegevoegd en mochten gedurende 2 minuten incuberen, waarna nog een wasbeurt met AB-buffer werd gedaan. De stroomcel werd geïncubeerd met 15 µl biotinylated phalloidin actine filamenten (250 nM) gedurende 5 min, gevolgd door een 100-µl wassen met AB buffer. Tenslotte werd de cel geladen met 20 µl beeldvormingsbuffer, inclusief calmoduline-uitgewisseld myosine V, 5 µM calmoduline, 300 nM ATP, een ATP-regeneratiesysteem (0,1 mg·ml-1 creatinefosfokinase/1 mM creatinefosfaat) en 0,5% (vol/vol) Triton-X 100 om de niet-specifieke binding te verminderen. De cel werd afgesloten met vacuümvet en onmiddellijk afgebeeld. De definitieve motorconcentratie resulteerde in schaars verfraaide actin en stond zo een analyse van enige myosin V molecules toe.
voor de DNA-experimenten werden de biotine-BSA en Neutravidine op dezelfde wijze geladen als voor de myosine V-experimenten, maar de wasbeurten werden gedaan met T50-buffer (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Zodra de stroomcel een Neutravidinecoating had, werd 15 µlof dsDNA (30 nM) in T50-buffer met 1 mg·ml-1 BSA binnengestroomd en gedurende 2 minuten geïncubeerd, waarna 100 µl beeldvormingsbuffer werd binnengestroomd. De stroomcel werd vervolgens afgedicht met vacuümvet en onmiddellijk afgebeeld. De resulterende decoratie van de molecules van DNA op de oppervlakte was voldoende schaars dat de fluorescente vlekken van verschillende molecules zelden overlapten.
Microscoopinstallatie. De totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscoop werd opgezet zoals beschreven in ref. 8, met enkele wijzigingen (Fig. 5, die als ondersteunende informatie op de PNAS-website wordt gepubliceerd). Excitatiebronbundels bij 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) en 633 nm (JDS Unifase, San Jose, CA) werden gecombineerd door een dichroische spiegel en uitgebreid tot een diameter van 7 mm. Deze bronnen werden gefocust (brandpuntsafstand = 500 mm) op het achterste brandpuntsvlak van een Olympus 1,65 na ×100 TIRF-doelstelling door middel van een laserlijn dichroïc op een lineaire translatiefase die microscoop-operatie in beide epifluorescentie-of TIRF-modi mogelijk maakt. Het doel werd geplaatst onder een gesloten-loop, twee-assige, piëzo nanotransformatie fase uitgerust met capacitieve sensoren voor positiemeting (Physik Instrumentente, Auburn, MA). Het gereflecteerde licht dat de achteropening van het object verlaat, werd op een kwadrant fotodiode gericht om een signaal te geven voor een focusfeedbacklus die de afstand tussen het object en het monster vasthield met een elektrostrictieve actuator (Newport, Fountain Valley, CA). De fluorescentie-emissie werd verzameld door de objective, doorgegeven door twee StopLine thin film notch filters (Semrock, Rochester, NY), Een voor elke excitatie bron, en verzonden via een dual-view apparaat dat gelijktijdige weergave van de Cy3 en Cy5 kanalen op een enkele IXON DV 887 EMCCD camera (Andor Technology, Belfast, Ierland). Alle gegevens werden afgebeeld met een 0.5-sec integratietijd. Kruisverwijzing tussen de twee kanalen (10%) vertraagt vermoedelijk de afstandsmetingen naar kleinere waarden. Onze experimentele fout, echter, maakt het undetectable, zoals getoond door Monte Carlo simulaties waarin 100 paren gemodelleerde beelden van enige fluorophores gescheiden door 10 nm werden gecreeerd en identiek geanalyseerd zoals met de gegevens van DNA (hieronder beschreven). De gesimuleerde beelden van de functies van de fluorescente puntspreiding werden berekend door een geïntegreerde 2D Gaussian intensiteitsdistributie met een constante achtergrond te produceren waaraan geschoten lawaai werd toegevoegd. De gesimuleerde pieken hadden dezelfde afmetingen en signaal-ruisverhouding als de echte pieken. Gesimuleerde gegevens met 10% kruisverwijzing en gesimuleerde gegevens zonder kruisverwijzing zijn niet te onderscheiden door een Kolmogorov-Smirnov-test (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Gegevensanalyse. Een registratie mapping van de Cy3 en Cy5 kanalen werd uitgevoerd met fiducials bestaande uit 100-nm Transfluosfeer parels (moleculaire Probes). Ze werden opgewonden bij 532 nm, en ze zenden uit met een breed emissiespectrum. De kraal was detecteerbaar in onze beide kanalen. We vonden een enkele kraal geassocieerd met de coverslip, en met onze piëzo-fase trapten we het met nanometer precisie in een raster patroon (met een 0.5-µm afstand), het nemen van een beeld bij elke stop. Het eindresultaat was een stapel van 312 beelden die de kraal in beide kanalen op verschillende posities (Fig. 1 bis).
de DNA-gegevens werden geanalyseerd door zelfgemaakte software met behulp van matlab (Mathworks, Natick, MA). De routine lokaliseert automatisch pieken in het beeld door de pixels van hoge intensiteit te bepalen en zorgt ervoor dat de omringende pixels intensiteiten hebben zoals verwacht voor één enkele fluorophore. Voordat we de pieken aanpassen aan een 2D Gaussiaanse functie om zijn centrale locaties te krijgen, zoeken we naar paren van pieken. De pixels in het Cy5-kanaal worden toegewezen aan het Cy3-kanaal en er wordt gezocht naar pieken in de omliggende Cy3-pixels. Als een piek wordt gevonden, dan worden de Cy5-piek en de Cy3-piek beschouwd als een paar voor verdere analyse. Elke piek is geschikt voor een 2D Gaussiaanse functie in zijn respectievelijke ruimte zoals beschreven voor de parels hierboven (Eq. 1 ). De fout op de geschikte gemiddelde locatie wordt berekend met het aantal verzamelde fotonen (Ny), 
de locatie van Cy5 wordt toegewezen aan het Cy3-kanaal, en de afstand tussen hen wordt berekend. Na de computationele analyse van de gegevens van DNA, werden de geà dentificeerde fluorophore paren handmatig gescreend om ervoor te zorgen dat de paren niet dicht bij een andere fluorophores waren die in de analyse van de paren zouden hebben bemoeid.
de myosine V-gegevens werden geanalyseerd door eerst een bewegende motor met het oog te identificeren. Zelfgemaakte software geschreven in matlab past vervolgens het startpaar fluorescerende pieken aan 2D Gaussiaanse functies zoals hierboven beschreven en bleef de pieken volgen zolang de gebruiker opgegeven. Motoren waarvan de geconjugeerde kleurstoffen elk in een enkele stap werden geanalyseerd, zoals het geval was voor de meeste waargenomen motoren, wat ervoor zorgde dat we inderdaad motoren met slechts één CY3-label en één Cy5-label bestudeerden. De resulterende trajecten werden geregistreerd door het Cy5 traject in kaart te brengen op het Cy3 kanaal. Een kleinste kwadraten lineair passend op de punten van beide trajecten gaf de oriëntatie van het actine filament waarop de trajecten werden geprojecteerd. Afstanden langs de lineaire pasvorm (de actine gloeidraad) werden uitgezet tegen de tijd om de relatieve afstanden van de koppen te zien (Fig. 4).
tijdspoor van een differentieel geëtiketteerd myosine-V-molecuul dat langs een actinefilament loopt. De etiketten (Cy3 en Cy5) zijn covalent in bijlage aan calmodulins die op de molecule myosin V werden uitgewisseld. In dit spoor, nemen beide plaatsen van de fluorescente sonde stappen 72 nm, die erop wijzen dat de calmodulins dicht bij het motordomein werden uitgewisseld. De afwisselende posities van de sondes bieden een directe observatie van het hand-over-hand loopmechanisme van myosine V.