Poisson distribution, vernoemd naar de Franse wiskundige Siméon Denis Poisson, is de waarschijnlijkheid van het optreden van een bepaald aantal gebeurtenissen in een bepaalde (vaste) periode als de gebeurtenissen plaatsvinden met een constante snelheid (bekend) en onafhankelijk zijn van het optreden van de vorige gebeurtenis. Het is gebaseerd op een discrete kansverdeling, waarbij de reeks uitkomsten discreet of eindig zijn, zoals het gooien van een munt of dobbelstenen.
in de context van een digitaal PCR-experiment zijn de discrete resultaten de aanwezigheid of afwezigheid van het doelgen. De duizenden individuele verdelingen die voor een digitale PCR-reactie worden geproduceerd worden verwacht om een poissondistributie te volgen aangezien de verdelingen monodispersed zijn en zij het gelijkwaardige volume van de steekproefmix bevatten.
als niet aan deze parameters wordt voldaan en de partities polydispersiteit vertonen, zal het volume van de monstermix in de partities sterk variëren en kunnen de grotere partities meer doelwitten bevatten dan de kleinere, waardoor de precisie van de digitale PCR-reactie afneemt.
in dit item nemen we u mee door de wiskundige berekening van de Poissonwet voor een digitaal PCR-experiment.
voor een digitaal PCR-experiment, een put met de gepartitioneerde steekproef van belang, en een doelgen om te kwantificeren, moeten we eerst de volgende variabelen definiëren:
- \(N\): totaal aantal analyzable partities in het goed
- \p\): aantal positieve partities voor de doel-gen
- \(v\): volume van de partitie (in µL), uitgegaan van constante
- \(d\): verdunningsfactor gebruikt voor het verdunnen van de steekproef uit de voorraad op het goed
(bijvoorbeeld \(d=10\) betekent het monster verdund 10 keer)
en vervolgens op deze aanvullende maatregelen,:
-
\( V = N \ v\) : totaal partitie volume geïnjecteerd in het goed
-
\(C_{0}\) : concentratie van genen in de put (in kopieën/µL)
-
\(C = d \ C_{0}\) : concentratie van genen in de voorraad (in kopieën/µL)
-
\(\lambda = C_{0} \ v\) : gemiddeld aantal genen per partitie in de put
De verdeling van de target genen ingekapseld in de partities van de goed volgt een Poisson-verdeling van de parameter \(\lambda\) :
Proba ( partitie kapselt \(\text{$k$}\) target genen ) \(= \dfrac{\lambda^k -} {k!} e^{- \lambda}\)
een partitie wordt gezegd:
-
“Positieve partitie” als het ingekapseld minstens 1 doel-gen (in welk geval we zullen het bekijken van een tl-partitie aan het einde punt van de versterking proces, dus de meeste van de onzekerheid ligt in deze “minstens één” toestand)
-
“Negatieve partitie” als ingekapseld 0 target-gen (in welk geval we zullen het bekijken van een niet-tl-partitie aan het eind van het amplificatieproces)
de verdeling van De positieve partities in het goed een binomiale verdeling van de kans \(1 – e^{-\lambda}\):
- Kans (ook bevat \(\text{$p$}\) positieve partities \(= {\rm C}_{N}^{p} (1 – e^{-\lambda})^p (e^{-\lambda} )^{N-p} \)
- Waarschijnlijkheid (partitie is negatief) \( = e^{-\lambda} \)
- Waarschijnlijkheid (partitie is positief) \( = 1 – e^{-\lambda} \)
Als \(N\) is groot genoeg:
- Proba (partitie is positief) \(= \dfrac{p}{N} \)
Dus de formule voor de verwachte voorraad concentratie:
\ (C = – \dfrac{d}{v} \ ln {\left(1 – \ dfrac{p}{N} \ right)} \)
Als u de geschatte concentraties van doelgenen automatisch moet berekenen, samen met hun betrouwbaarheidsinterval en relatieve onzekerheid, is er een online tool beschikbaar: Poisson Law: Going Further. Probeer het!
voor meer informatie over de onzekerheidscurves en de detectielimieten en kwantificeringsgrenzen, zie het item: dynamische detectiebereiken & kwantificering.