oncologische rapporten

introductie

longkanker is een kwaadaardige tumor met de hoogste morbiditeit en mortaliteit wereldwijd, en de incidentie ervan neemt toe. Ongeveer 80% van de ziekte kan worden toegeschreven aan tonon-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) (1). Vanwege de beperkingen van vroege diagnostische technieken en het ontbreken van vroege specifieke klinische manifestaties, wordt 70-80% van de patiënten gediagnosticeerd in een gevorderd stadium(2). Daarom is de identificatie van een veilige en effectieve geneesmiddelenbehandeling voor NSCLC cruciaal.

recente bevindingen hebben aangetoond dat de incidentie,ontwikkeling en overdracht van NSCLC niet alleen worden beïnvloed door genetische factoren, maar dat epigenetische verandering ook belangrijk is,waaronder kleinmolecuul niet-coderend RNA (ncRNA) (3). MicroRNA( miRNA), kan een klasse van endogene kleine ncRNA met een lengte van ~21-25 basissen, wijd bestaande ineukaryotes, mRNA van een specifiek doelgen(4) identificeren. Meer dan 50% van miRNAs genes worden in NSCLC-verwante breekbare plaatsen of genomic gebieden in kaart gebracht,die voorstellen dat miRNA uitdrukking nauw met NSCLC kan worden geassocieerd. Zoals gemeld, bevordert de uitdrukking van een groot aantal miRNAs inNSCLC wanorde en de onbalans van miRNAs de vooruitgang van NSCLC celcyclus, anti-apoptotic effect, enhancedcell invasie en metastase van niet-kleincellige longkanker(5).

de PI3K/Akt signaalweg speelt een belangrijke rol bij groeifactor-gemedieerde celoverleving. Eerdere bevindingen hebben aangetoond dat de aandoening van de PI3K/Akt/mTOR-route een belangrijke rol kan spelen bij de vorming van NSCLC (6). Er is ook gemeld dat het celliferatiesignaal dat wordt gegenereerd door de combinatie van een aantal transmembraanreceptoren en liganden, de signaaltransductie van PI3K/Akt/mTOR kan activeren, wat nauw samenhangt met de proliferatie en overlevingsstatus van kleincellig longcarcinoom (7). Deze receptoren omvatten C-met,epidermale groeifactor receptor (EGFR), c-kit en insuline-achtige groeifactor receptor (IGF-IR).

curcumine is een natuurlijk werkzaam bestanddeel dat wordt gewonnen uit de droge wortelstok van de kurkuma-plant van het geslacht kurkuma, kurkuma en kurkuma, met uitgebreide farmacologische effecten, lage toxiciteit, en goede tolerantie, en vanwege zijn economische waarde is het een hotspot voor exploratie geworden (8). De bevindingen van studies gericht op curcumine hebben een breed scala aan farmaceutische activiteiten geïdentificeerd,zoals anti-inflammatie, anti-oxidatie, lipiden, anti-virus, anti-infectie,antikanker, anticoagulans, anti-leverfibrose en atherosclerose, lage toxiciteit en weinig bijwerkingen (9-13).Het effect van curcumine op NSCLC en het onderliggende moleculaire mechanisme blijft echter onduidelijk. In de huidige studie onderzocht wee het kankerbestrijdende effect van curcumine op celproliferatie en apoptose van humaan NSCLC en identificeerde een mogelijke relatie tussen dit effect en de miRNA-192-5p-gemoduleerde PI3K/Aktsignaling route.

materialen en methoden

chemicaliën

Dulbecco ’s modified Eagle’ s medium (DMEM) en fetalcalf serum (FBS) werden gekocht bij Gibco (Carlsbad, CA, USA) en(Zuid-Amerika). 3 – (4,5-Dimethyl-thylthiazool-2-yl)-2,5 difenyltetrazoliumbromide (MTT) is aangekocht bij Sangon Biotech(Shanghai, China). De Apoptosis Detection kit werd ik aangeschaft vanbd Biosciences (San Jose, CA, USA). De caspase-3 activiteit assaykit werd gekocht bij Promega (Madison, WI, USA).

celcultuur

humane normale NCL-H460 en BEAS-2E long epithelcellen, en menselijke a549 longkankercellen werden verkregen van het CellResource Center van de tweede Militaire Medische Universiteit. Deze cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS (beide van Gibco), 100 U/ml penicilline en 100 µg/ml streptomycine bij 37°C en een bevochtigde incubator met 5% CO2. De concentraties (5,10,20 en 40 µM) en tijdsperioden (12 en 24 uur) van curcumine tegen A549 cellen werden onderzocht. De chemische structuur van curcumine is weergegeven in Fig.1.

analyse van de levensvatbaarheid van cellen

cellen werden gezaaid met een dichtheid van 5×103/put in 96-putplaten. In het kort werd de celviabiliteitmet behulp van MTT-assay (sangon Biotech) gemeten. Tien microliters MTT (5mg/l) werden in elk putje toegevoegd en gedurende 4 uur bij 37°C geïncubeerd in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Dimethylsulfoxide (150 µl; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) werden toegevoegd aan elke put en geagiteerd gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. De absorptie werd gemeten bij 450 nM met behulp van amicroplate reader.

Annexine V-FITC/propidium jodide (PI)apoptose analyse

cellen werden gezaaid met een dichtheid van 1×106/putje in 6-putje platen. Gekweekte cellen werden gewassen met ijskoude PBS en vervolgens gekleurd met Annexin V-FITC en PIusing de Apoptosis detectie kit I volgens de instructies van de fabrikant (Bd Biosciences). Apoptosis werd geanalyseerd via flowcytometric met behulp van CellQuest Pro (IVD) software (beide van BDBiosciences).

caspase-3-activeringsanalyse

cellen werden gezaaid met een dichtheid van 5×103 / put in 96-putplaten. De caspase-3-activiteit werd gemeten met behulp van een caspase-3-activiteitstest volgens de instructies van de fabrikant (Promega). Honderd microliterreactiebuffer met 10 µl substraat Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (PNA) werd toegevoegd aan 10 µl proteincell-lysaat/put en geïncubeerd bij 37°C gedurende 6 uur. Caspase-3-activiteit werd geanalyseerd bij een absorptie van 405 nm.

Celtransfectie

de miR-192-5p, anti-mir-192-5p en negatieve controlmimics (miR-NC) werden allemaal gekocht van Sangon Biotech. De cellen werden gezaaid in 6-Wells platen en gegroeid tot 50-60% samenvloeiing voorafgaand aan transfectie. De mimics werden getransfecteerd met Lipofectamine2000 in cellen volgens de instructies van de fabrikant(Invitrogen Life Technologies). Gen of eiwit werd geà soleerd 24 hafter transfectie en gebruikt voor reverse transcriptie-quantitativepolymerase kettingreactie (RT-qPCR) of western blot analyse,respectievelijk.

RT-qPCR

cellen werden gezaaid met een dichtheid van 5×103 / putje in 96-putje platen. Totaal RNA werd uit de cellen gehaald met behulp van TRIzol-reagens (Invitrogen Life Technologies).De concentratie RNA werd bepaald met behulp van een NanoDrop ® ND-1000 spectrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, USA). De kwantificering van miRNAs werd uitgevoerd door de Testuitrusting van TaqMan miRNA (Toegepaste Biosystems, Foster City, CA,USA). Totaal RNA werd onderworpen aan eerste-streng cDNA synthese en onderzocht met behulp van een PRIMESCRIPT RT reagenskit (beide uit Takara,Shiga, Japan). qPCR werd uitgevoerd met SYBR-Green PCR Master Mix (Takara) op het ABI 7500HT systeem. De in de acties gebruikte primers zijn weergegeven in Tabel I.

tabel I de PCR-primers die bij de behandelingen worden gebruikt.

Western blot analyse

cellen werden gezaaid met een dichtheid van 5×103 / putje in 96-putje platen. Gekweekte cellen werden gewassen met ijskoude PBS en geïncubeerd met ijskoude lysis buffer gedurende 30 minuten op ijs. Celvloeistof werd verzameld en gecentrifugeerd bij 12.000 × g gedurende 10 min bij 4°C. De oplosbare eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van een BCA eiwit assay kit (Sigma, St.Louis, MO,USA). Totale eiwitten (10 µg) werden uitgevoerd op 12% natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamide gels en overgebracht naar polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen. De membranen werden geblokkeerd met tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) die 5% vetvrije melk bevatte om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren. De membranen werden geïncubeerd met anti-PI3K (1: 1.500) en anti-Akt (1: 1000) (beide van Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) en anti-β-actine (1:500;sangon Biotech) ‘ s nachts bij 4°C. Na gewassen te zijn met 1% Tween-20/PBS, werden de membranen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met de secondaryantilichamen (Tiangen, Beijing, China).De eiwitten werden gedetecteerd met behulp van versterkte chemiluminescentie (Vilber, Marne La Vallée, Frankrijk).

statistische analyse

statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS 19.0-software. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SD. De resultaten werden geanalyseerd met behulp van de T-test van de Student of eenrichtingsanalyse van variantie(ANOVA). P<0,05 werd statistisch significant geacht.

resultaten

curcumine remt de levensvatbaarheid van A549-cellen

de concentraties (5, 10, 20 en 40 µM) en tijdsperioden (12, 24 of 36 uur) van curcumine tegen a549-cellen werden beoordeeld met behulp van de MTT-test. Fig.2 toont aan dat de behandeling van a549 cellen voor 12, 24 of 48 h met 10, 20 en 40 µM curcumine de levensvatbaarheid van de cellen op adose – en tijdsafhankelijke wijze remde. Uit de MTT-test bleek dat een behandeling met curcumine (20 en 40 µM) gedurende 24 of 36 uur een onbeduidende levensvatbaarheid van de cellen opleverde in vergelijking met de controlegroep(Fig. 2).

curcumine induceert apoptose van A549-cellen

voorafgaand aan de behandeling werd ook de apoptotische snelheid van met curcumine behandelde A549-cellen (10, 20 of 40 µM) gemeten. Na behandeling met 20 of 40 µM curcumine gedurende 24 uur, nam de apoptotische snelheid aanzienlijk toe in een dosisafhankelijke scanner, vergeleken met de controlegroep (Fig. 3).

curcumine induceert caspase-3 activiteit vana549 cellen

om te bepalen of curcumine caspase-3 activiteit van a549 cellen induceert, werd de caspase-3 activiteit gemeten met behulp van de acaspase-3 activity assay kit. De caspase-3-activiteit nam ook aanzienlijk toe op een dosisafhankelijke manier na een behandeling met curcumine (20 of 40µM) gedurende 24 uur, vergeleken met de controlegroep(Fig. 4). Deze resultaten gaven aan dat curcumine apoptose veroorzaakte in A549 cellen.

mir-192-5p remt de levensvatbaarheid van de cellen en vermindert apoptose van a549 cellen

om de expressie en significantie van Mir-192-5p in humane normale long epitheliale en longkankercellen te onderzoeken,werd de relatieve expressie van Mir-192-5p gedetecteerd met RT-qPCR.Fig. 5A toont aan dat miR-192-5prelatieve uitdrukking van NCL-h460 cellen relatief lager was, dat van a549 cellen hoger was, met Beas-2E cellen die het hoogst uitgedrukt zijn.

om te analyseren of miR-192-5p de cellvabiliteit en apoptose van a549-cellen beïnvloedde, transformeerden we miR-192-5pmimics in a549-cellen. De getransfecteerde cellen met miR-192-5pmimics toonden een significante, 120-voudige verhoging van miR-192-5pexpressie na 48 h-transfectie, vergeleken met de controle ormir-NC groep (Fig. 5B).Overexpressie van miR-192-5p verminderde de levensvatbaarheid van a549 cellen, vergeleken met de controle of mir-NC groep (Fig. 5C). Nochtans, veroorzaakte de overexpressie van Mir-192-5p het apoptotic tarief van a549 cellen, vergeleken met de controle of mir-NC groep (Fig.5D).

remming van miR-192-5p onderdrukt de cellulaire werking en induceert apoptose van a549-cellen

om te bepalen of anti-mir-192-5p de cellevensvatbaarheid en apoptose van a549-cellen beïnvloedde, transfecteerden we Anti-miR-192-5p-nabootsingen in a549-cellen. Het uitdrukkingsniveau van Mir-192-5p werd ontdekt gebruikend RT-qPCR na 48 h transfectie.Anti-mir-192-5p bootst effectief de MIR-192-5prelatieve uitdrukking van a549 cellen (Fig.6 bis). Downregulation van Mir-192-5p bevorderde de levensvatbaarheid van de cel en remde het apoptotic tarief van a549 cellen, respectievelijk, vergeleken met de controle of mir-NC groep (Fig.6B en C).

curcumine remt de MIR-192-5p geneexpressie van a549 cellen

om te bepalen of curcumine de MIR-192-5pgene expressie van a549 cellen beïnvloedde, werd het expressieniveau van Mir-192-5P gedetecteerd met RT-qPCR na behandeling met curcumine gedurende 24 uur. Fig. 7 toont aan dat het expressieniveau van Mir-192-5p duidelijk werd versterkt door curcumine (20 of 40µM).

mir-192-5p remt het effect van curcumine op de levensvatbaarheid van cellen en induceert apoptose van a549 cellen

om te onderzoeken hoe de overexpressie van Mir-192-5P het effect van curcumine op de levensvatbaarheid van cellen en de optotische snelheid van a549 cellen beïnvloedde, transfecteerden we miR-192-5p in a549 cellen. Fig. 8 toont aan dat curcumine de levensvatbaarheid van de cellen onderdrukte en het apoptotische percentage van A549 cellen verhoogde na behandeling met curcumine (20 µM) gedurende 24 uur, respectievelijk in vergelijking met de controlegroep. Het effect van curcumine (20 µM) op de levensvatbaarheid van de cellen en de apoptotische snelheid van a549 cellen waren duidelijk afgenomen en verhoogd met respectievelijk mir-192-5pmimics, vergeleken met de met curcumine behandelde groep(Fig. 8A).

remming van Mir-192-5p onderdrukt het effect van curcumine op de levensvatbaarheid van cellen en induceert apoptose van A549-cellen

om te onderzoeken hoe de downregulatie van miR-192-5P het effect van curcumine op de levensvatbaarheid van cellen en de optotische snelheid van a549-cellen beïnvloedde, transfecteerden we anti-mir-192-5p-nabootsingen in a549-cellen. Fig. 9 toont aan dat curcumine de levensvatbaarheid van de cellen onderdrukte en het apoptotische percentage van A549 cellen verhoogde na behandeling met curcumine (20 µM) gedurende 24 uur, respectievelijk in vergelijking met de controlegroep. Echter, het effect van curcumine (20 µM) op de levensvatbaarheid van de cellen en de optotische snelheid van a549 cellen werden duidelijk verhoogd en verminderd door anti-mir-192-5p nabootsingen, respectievelijk, vergeleken met de met curcumine behandelde groep (Fig.9 bis).

curcumine remt de PI3K / Akt-proteïneexpressie van a549-cellen

om te bepalen of curcumine de PI3K/Akt-Proteïneexpressie van a549-cellen beïnvloedde, werd de PI3K/AKT-eiwitexpressie gedetecteerd met behulp van western blot-analyse na behandeling met curcumine gedurende 24 uur. Fig. 10 toont aan dat de proteïneuitdrukking PI3K/Akt duidelijk verbeterd werd door curcumine (20 of 40 µM).

mir-192-5p richt zich direct op PI3K / Akt van a549-cellen

om te onderzoeken hoe overexpressie van miR-192-5P de PI3K/AKT-eiwitexpressie van a549-cellen beïnvloedde, waarbij mir-192-5p wordt omgezet in a549-cellen. Fig. 11a en B tonen aan dat curcumine de PI3K/Akt eiwituitdrukkingen van A549 cellen na behandeling met curcumine (20 µM) gedurende 24 uur ondersteunde, in vergelijking met de controlegroep. Het effect van curcumine (20 µM) op de PI3K/Akt-eiwitexpressie van a549-cellen was duidelijk verminderd door imitaties van Mir-192-5p, vergeleken met de met curcumine behandelde groep(Fig. 11C en D).

remming van miR-192-5p verhoogt de PI3K/Akt-expressie van A549-cellen

om te bepalen of anti-mir-192-5p het effect van curcumine op PI3K/AKT-eiwitexpressie van a549-cellen beïnvloedde. Fig. Uit 12a en B blijkt dat curcumine de PI3K/Akt-eiwitexpressie van A549-cellen na behandeling met curcumine (20 µM) gedurende 24 uur, respectievelijk in vergelijking met de controlegroep,onderhield. Nochtans, werd het effect van curcumine(20 µM) op de PI3K/AKT eiwituitdrukking van a549 cellen duidelijk versterkt door anti-mir-192-5p nabootst, respectievelijk, vergeleken met de met curcumine behandelde groep (Fig.12C en D).

discussie

een miljoen patiënten bezwijken jaarlijks aan NSCLC wereldwijd, en de incidentie van NSCLC neemt geleidelijk toe.Hoewel een aantal studies in de afgelopen jaren zijn gericht op NSCLC,is er geen grote vooruitgang geboekt met betrekking tot de behandeling. Chirurgie blijft de meest effectieve behandelingsmethode, maar zowel op het gebied van preventie als op het gebied van de pathogenese van NSCLC moeten verdere studies worden uitgevoerd (14,15). Onlangs hebben Liu et al vastgesteld dat curcumine proliferatie remt en de Cell apoptotische snelheid van maagkankercellen significant induceert (16). Ma et al toonden aan dat curcumine de celgroei en invasie van pancreaskanker remt (17). Gezamenlijk gaven onze bevindingen aan dat curcumine de levensvatbaarheid van cellen onderdrukte, cell apoptose induceerde en de caspase-3-activiteit van a549-cellen verhoogde.Daarom is curcumine een potentieel geneesmiddel voor oncotherapie.

miRNA is een klasse van KLEINMOLECUUL RNA dat een zeer belangrijke rol speelt in de genexpressieregulatie zoals onlangs geïdentificeerd (18). de genen van miRNA worden gewoonlijk gevestigd in intron segmenten van Gen. Nochtans, worden miRNAs ook buiten niet-codeert exons van het gen en het intergenic gebied gedistribueerd, die om in avariety van bekende ONC ogenic wegen, zoals p53, Bcl-2 en K-Ras(19) zijn gevonden deel te nemen. Er is aangetoond dat>50% van de gedefinieerde humane mirna ‘ s zich bevinden in de fragiele plaatsen van het genoom en deze fragiele plaatsen worden vaak geassocieerd met het optreden van NSCLC (20). De expressieprofielen van miRNAs worden geassocieerd met de ontwikkeling van NSCLC. miR-34c, miR-145 en miR-142 kunnen NSCLC remmen (5). De resultaten van de huidige studie wijzen uit dat miR-192-5p relatieve expressie van NCL-H460 cellen relatief laag was, dat van a549 cellen hoger was, met BEAS-2E cellen die het hoogst tot expressie kwamen. De overexpressie van miR-192-5P verminderde de levensvatbaarheid van de cel en verhoogde het apoptotische tarief van a549 cellen. Downregulation van miR-192-5p verhoogde de cellviability en verminderde het apoptotic tarief van a549 cellen.Bovendien remde curcumine mir-192-5P genexpressie van A549cells. Nochtans, verbeterde de upregulation van Mir-192-5P uitdrukking het effect van curcumine op cellevensvatbaarheid en het apoptotic tarief van a549 cellen, terwijl de downregulation van Mir-192-5P expression het effect van curcumine op a549 cellen veranderde. Onze resultaten waren in overeenstemming met die van andere studies. Bijvoorbeeld, rapporteerde ye etal dat curcumine celapoptosis bevordert door mir-192-5p (21) te activeren. Nochtans, zijn de problematische mechanismen over hoe curcumine mir-192-5pexpressie beà nvloedt onduidelijk en toekomstige studies om dit effect te bepalen zouden moeten worden uitgevoerd.

In de afgelopen jaren heeft het effect van de PI3K/Aktsignaling-route op menselijk NSCLC veel aandacht gekregen(22). Activering van de PI3K / Aktsignaling route is zeer gebruikelijk in humaan NSCLC, die het voorkomen van kanker kan bevorderen door middel van een verscheidenheid van mechanismen, met inbegrip van genenmutaties, vermindering van kanker suppressor gen Ptenexpressie, PI3K mutatie of amplificatie, AKT mutatie oramplificatie en oncogene receptor activering (7). De activering van elke component van deze weg is de belangrijkste reden voor de ongunstige prognose van NSCLC,die tot drugresistentie van de behandeling kan leiden, zodat remming van deze weg drugresistentie kan omkeren en emotherapie en stralingseffecten in vivo kan verbeteren (23). De gegevens die in de huidige studie werden verkregen, toonden aan dat curcumine de PI3K/AKT proteïneexpressie van a549 cellen onderdrukte. Upregulation van Mir-192-5P expressionrefrained de PI3K / AKT eiwituitdrukking van a549 cellen.Downregulation van Mir-192-5P uitdrukking kan de PI3K/Aktprotein uitdrukking van a549 cellen verhogen. Xu et al hebben aangetoond dat curcumine de invasie en migratie van FTC133 cellvia downregulatie van de PI3K/Akt signaalweg in thyroidkanker cellen remt (24). Xu et alsuggested dat curcumine tumorproliferatie van longkanker remt via de PI3K / Akt Route (25).Schee et al onthulde dat miR-22-3p, mir-143-3p andmiR-192-5p geregeld en betrokken waren bij APC, TGFß en PI3Kpathway in colorectale kankercellen (26).Concluderend was deze studie gericht op het effect van curcumine tegen A549 cellen, inhibeerde celproliferatie en veroorzaakte apoptose van humaan NSCLC door de upregulatie van Mir-192-5p en suppressie van de PI3K/Akt signaalweg. De conclusies van deze studie wijzen erop dat curcumine een potentieel doelwit is bij de behandeling van NSCLC. Nochtans, onthulde de huidige studie enkele beperkingen aangezien wij de gedetailleerde relatie tussen MIR-192-5p en de PI3K/AKT-weg in longkanker cellen niet onderzochten. Aanvullende studies in vivo, klinische en grootschaligere statistische analyses van het onderhavige onderzoek moeten worden uitgevoerd om de resultaten te verifiëren.