PMC

Pseudomonas aeruginosa jest wszechobecną bakterią Gram-ujemną znajdującą się w glebie i wodzie. Jest również patogenem oportunistycznym, który powoduje zakażenia u osób z wrodzonymi wadami immunologicznymi, w tym u pacjentów z mukowiscydozą (CF) (8). P. aeruginosa spotyka środowiska o niskiej zawartości tlenu w glebie i wodzie. Dowody wskazują, że u ludzi z mukowiscydozą bakterie mogą, przynajmniej częściowo, znajdować się w środowisku o niskiej zawartości tlenu w mukopurulentnych masach lub biofilmach w obrębie dróg oddechowych (19). P. aeruginosa jest w stanie rosnąć beztlenowo w obecności końcowych akceptorów elektronów, takich jak azotan (NO3−), azotyn (NO2−) i podtlenek azotu (N2O) lub gdy L-arginina jest substratem wzrostu (21). Śluzu dróg oddechowych CF jest wystarczająco bogaty w NO3-i NO2-do wspierania beztlenowego wzrostu P. aeruginosa (7, 19). W badaniu tym przeprowadzono porównanie proteomu P. aeruginosa podczas wzrostu w obecności i braku tlenu.

P. szczep aeruginosa pao1 otrzymany od Steve 'a Lory’ ego (Harvard Medical School, Boston, MA) był hodowany w 125-ml kolbach w bulionie Luria (LB) uzupełnionym 1% KNO3 z wytrząsaniem przy 200 obr. / min w 37°C dla wzrostu tlenowego. Wzrost beztlenowy został zakończony, jak opisano poprzednio (9) W 80 ml pożywki w 100 ml butelkach z serum Wheatona (Fisher Scientific) z gumowymi korkami. Pożywkę pozbawiono tlenu, poddając ją bulgoczeniu gazem N2 przez 1 godzinę. Zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, bakterie zebrano w późnej logarytmicznej fazie wzrostu, w której gęstość komórek (gęstość optyczna przy 600 nm) hodowli beztlenowej wynosiła 44% gęstości hodowli tlenowej. Nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy pH zebranych kultur (pH 7,6 dla kultury beztlenowej i pH 7,4 dla kultury tlenowej). Równe ilości denaturowanego i zredukowanego białka pełnokomórkowego (2.0 mg z każdego stanu wzrostu) znakowano lekkim (12C) lub ciężkim (13C) odczynnikiem kodowanym izotopem powinowactwa (ICAT) (Applied Biosystems, Foster City, CA), przetwarzano i analizowano zgodnie z wcześniejszym opisem (3). Podane dane to średnie z co najmniej dwóch niezależnych eksperymentów.

zidentyfikowano i oznaczono ilościowo 600 białek P. aeruginosa za pomocą ICAT (Pełny wykaz białek znajduje się w tabeli S1 w materiale uzupełniającym). Spośród 151 białek, których obfitość zmieniła się podczas wzrostu beztlenowego, 76 było większych (tabela (Table1)1), A 75 było mniejszych (tabela (Table2).2). Zgodnie z oczekiwaniami, 13 białek uczestniczących w beztlenowym wzroście i denitryfikacji (w tym produkty genów nir, nos i Nar) uległo ekspresji na wyższych poziomach podczas wzrostu beztlenowego (tabela (Table1).1). Wyniki te sugerują, że obserwowane zmiany w zawartości białka obejmują zmiany wynikające w szczególności ze wzrostu przy różnych poziomach tlenu.

zmiany w wykrytym proteomie mogą również odzwierciedlać różnice we wszystkich regulacjach zależnych od gęstości, oprócz efektów napięcia tlenu, biorąc pod uwagę niższą względną gęstość komórek zebranej Kultury beztlenowej. Rzeczywiście, 29 białek wykrytych w mniejszej obfitości w komórkach hodowanych beztlenowo jest kodowanych przez geny, które wcześniej okazały się indukowane kworum (5, 16, 17). Należą do nich podjednostki syntazy cyjanowodoru HcnB i HcnC; Pseudomonas quinolone sygnalizują biosyntetyczne enzymy PqsB, PqsC i PqsD oraz PhnB (tabela (Table2).2). Zgodnie z naszymi Wynikami stwierdzono również, że geny hcn i pqs są transkrypcyjnie represjonowane podczas wzrostu beztlenowego poprzez niedawną analizę mikromacierzy DNA z wykorzystaniem kultur tlenowych i beztlenowych zebranych w tej samej gęstości komórek (1) (Tabela (Table22).

aby zidentyfikować wydzielonego P. białka aeruginosa ze zmienionymi poziomami podczas wzrostu beztlenowego, supernatanty hodowlane zatężono (11) i oddzielono siarczanem dodecylu sodu-elektroforezą w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE) (Fig. (Rys.1).1). Zidentyfikowano i przeanalizowano cztery pasma białkowe barwione przez Coomassie ’ ego, odpowiadające białkom o różnej ekspresji, tak jak w poprzednim badaniu (4) (Fig. (Rys.1).1). Podczas wzrostu beztlenowego zmniejszała się ilość trzech wydzielanych białek: białka wiążącego chitynę Cbpd, elastazy LasB i białka o nieznanej funkcji kodowanego przez PA0572. Wcześniejsze badania proteomiczne wykazały, że wszystkie trzy z tych białek są indukowane kworum (11). Jedno białko wydawało się być zwiększone w obfitości podczas wzrostu beztlenowego i zostało zidentyfikowane jako flagellar Filament Protein FliC lub flagellar capping protein FliD (ze względu na nakładanie się cech tych dwóch białek).

większość białek błony zewnętrznej P. aeruginosa nie zawiera reszt cysteiny i dlatego nie może być analizowana przez ICAT (4). W związku z tym jako metodę komplementarną zastosowano stronę dwuwymiarową (2D) (4). Kilka białek błony zewnętrznej (rys. (Rys.2) 2) zostały wycięte z żelu 2D i zidentyfikowane (4). OprE wydawało się zwiększać obfitość podczas wzrostu beztlenowego, podczas gdy OprF i OprH zdawały się zmniejszać obfitość (Fig. (Rys.2).2). Wszystkie trzy białka migrowały jako wiele gatunków podczas ogniskowania izoelektrycznego (Fig. (Rys.2).2). Zmniejszenie obfitości OprF podczas wzrostu beztlenowego zostało potwierdzone przez immunoblotting zewnętrznych białek błonowych (dane nie pokazane), przy użyciu poliklonalnej antysurowicy anty-OprF (prezent od Roberta Hancocka, University of British Columbia w Vancouver, Kanada).

wśród białek P. aeruginosa, które wykazały zwiększoną obfitość podczas wzrostu beztlenowego (tabela (Table1;1; Fig. Fig.1), 1), kilka przyczynia się do funkcji związanych z tworzeniem i rozwojem biofilmów. Białka te obejmują białko CRC kontroli represji katabolitów i drgające białka ruchliwości PilU, PilG i ChpA (12, 13, 18). Zgodnie ze zwiększonym poziomem Crc w komórkach hodowanych beztlenowo (Tabela (Tabela 1), 1),znane cele represji Crc były zmniejszone w obfitości (Tabela (Tabela 2), 2), w tym produkty genów hmgA i bkd (6, 10). ChpA i PilG są elementami złożonego systemu regulacyjnego kontrolującego ruchliwość drgań (18). Łącznie wyniki te sugerują, że ekspresja lub funkcja przydatków powierzchniowych komórek, które wpływają na tworzenie biofilmu, zmienia się podczas wzrostu beztlenowego. Takie zmiany mogą przyczyniać się do zwiększonego tworzenia biofilmu obserwowanego dla P. aeruginosa rosnącego beztlenowo (20).

oprócz zmian w białkach błony zewnętrznej obserwowanych podczas wzrostu beztlenowego, analiza ICAT wykazała, że kilka enzymów biorących udział w biosyntezie lipopolisacharydu P. aeruginosa (LPS) ulegało ekspresji na wyższych poziomach podczas wzrostu beztlenowego (tabela (Table1).1). Obejmowały one homologę beta-hydroksylazy LpxO2, która hydroksyluje lipidowe kwasy tłuszczowe a (14); heptozylotransferazy rdzeniowe LPS WaaC i WaaF (2, 15); i WbpG, który jest kodowany przez klaster genów, który uczestniczy w syntezie długiego antygenu B-band O. Wyniki te sugerują, że zawartość LPS może zostać zmieniona w wyniku anaerobiozy.

podsumowując, proteom P. aeruginosa zmienia się znacząco podczas wzrostu beztlenowego. Zidentyfikowano łącznie 617 białek: 610 metodą analizy ICAT, 4 metodą analizy SDS-PAGE i 3 metodą analizy 2D PAGE. Spośród 617 zidentyfikowanych białek, obfitość 158 różniła się między komórkami hodowanymi beztlenowo i tlenowo. Ponieważ P. aeruginosa osiągnął mniejszą gęstość komórek w Warunkach beztlenowego wzrostu niż w Warunkach tlenowego wzrostu, zależne od gęstości zmiany ekspresji białka mogły przyczynić się do proteomu, który wykryliśmy podczas wzrostu beztlenowego. Niemniej jednak gęstość komórek bakteryjnych prawdopodobnie będzie podobnie ograniczona w wielu niszach środowiskowych, w których brakuje wielu składników odżywczych (w tym tlenu). Dlatego zmiany w poziomie białka, które wykryliśmy, przyczyniają się do zrozumienia, w jaki sposób proteom i stan metaboliczny bakterii różnią się w odpowiedzi na różne środowiska. Bezpośrednia analiza zawartości białka bakteryjnego jest solidną technologią umożliwiającą obserwację adaptacji bakterii do specyficznych nisz środowiskowych, w tym dróg oddechowych CF.