A evidência acumulada da actividade da cinase no ensaio de coagulação Ocidental

sugere que as perturbações na sinalização da fosforilação/desphosforilação estão associadas a comportamentos patológicos das células. Os projectos fosfo-proteoma identificaram perto de 300 000 resíduos fosforilados de Ser/Thr / Tyr em proteínas celulares . Em paralelo, o Projeto Genoma Humano descobriu aproximadamente 500 cinases proteicas. No entanto, um número limitado de cinases proteicas foram atribuídas a cada local de fosforilação.

o ensaio de fosforilação em gel foi um método conveniente para detectar as actividades da proteína cinase em amostras solubilizadas com SDS. Este método foi aplicado para a identificação de CaMKII, MYPT1-K (ou ZIPK) e outros . Neste protocolo de ensaio, as cinases proteicas são carregadas num gel SDS-poliacrilamida embebido num substrato polipéptido, sendo depois submetidas a renaturação, fosforilação utilizando ATP radioactivo, seguido de autoradiografia para detectar substrato fosforilado. Além disso, foi detectada autofosforilação de cinases na membrana nitrocelulose ou fluoreto de polivinilideno (PVDF) utilizando ATP radioativo . O material radioactivo pode constituir uma limitação para os utilizadores, devido a regulamentos de segurança. Além disso, os autoradiogramas de proteínas fosforiladas carecem de qualquer informação sobre locais de fosforilação.

aqui, optimizámos um doseamento alternativo não radioactivo ao doseamento tradicional de fosforilação em gel. Batizado com atividade cinase western blotting( KAT-WB), isso detecta com sucesso Tyr-kinases que autofosforilato eles mesmos, bem como Ser/Thr-kinases que fosforilato uma proteína substrato de interesse em um local específico usando anticorpos específicos do fósforo (P).

a Figura 1 apresenta dados do KAT-WB para o ensaio de autofosforilação da Tyr-kinase. Para fazer bolhas duplicadas, duas alíquotas de um extracto foram carregadas num gel de poliacrilamida SDS, submetidas a electroforese, e então as proteínas foram transferidas para uma folha de membrana PVDF (0,2 µm). A membrana foi tratada sequencialmente com 2-propanol tamponado, cloridrato de guanidina de 6, 0 M (Gu-HCl), 3, 0 M Gu-HCl, tampão de 0,1 M Gu-HCl e tampão de renaturação (ver Protocolo suplementar). Após uma etapa de renaturação nocturna a 4 ° C, a membrana foi cortada longitudinalmente para gerar duas peças duplicadas (Figura 1). Incubou-se uma peça de membrana durante 60 minutos com 1 mm de pop. A outra parte da membrana foi incubada sem MgATP, como um controle. Ambas as folhas foram simultaneamente submetidas a imunodetecção com anticorpos anti-P-Tyr (Clone PY20 à diluição de 1:5000). Como indicado na Figura 1, foram detectadas múltiplas bandas de P-Tyr a 100, 70, 45 e 35 kDa na membrana de controlo (superior esquerda). Estas proteínas P-Tyr foram presumivelmente já fosforiladas antes da extracção. A incubação com MgATP após a separação elevou a fosforilação Tyr de uma proteína a 45 kDa em lisados musculares cardíacos (Figura 1, canto superior direito, faixa 2), indicando autofosforilação de resíduos de Tyr nesta cinase na membrana após a renaturação. A figura 1 mostra densitogramas da faixa 2 (-/+ MgATP). Para verificar a carga equivalente de proteína nas duas bolhas, os filtros foram submetidos a coloração de Coomassie (Figura 1, fundo). Uma nota técnica é que, no curso do desenvolvimento do método, descobrimos que os tratamentos com 2-propanol tamponado e 6M Gu-HCl eram ambos necessários para a detecção de atividades cinase. Portanto, KAT-WB detectou um Tyr kinase 45-kDa.

outra versão do KAT-WB usa fosforilação específica de um substrato absorvido na membrana PVDF, na proximidade da cinase. Usámos o inibidor da fosfatase holoenzima-1 (PHI-1) como proteína de interesse, cuja fosforilação na Thr57 converte esta proteína celular num inibidor da Ser/Thr fosfatase tipo 1 . A figura 2A mostra os dados de KAT-WB utilizando como controlo positivo o ZIPK recombinante, Uma Ser/Thr kinase conhecida por PHI-1 recombinante do fosforilato em Thr57 . Após a desnaturação e o passo-a-passo renaturation processo, a membrana estava de molho durante a noite a 4°C no renaturation buffer suplementado com recombinante PHI-1 tipo selvagem (WT) ou um nonphosphorylatable versão (T57H) de 0,2 mg/ml e, em seguida, a fosforilação de reação foi executado com MgATP. O PHI-1 fosforilado na membrana foi detectado utilizando o anticorpo anti-P-PHI-1 (Thr57), o que revelou uma banda do ZIPK recombinante. No entanto, apenas um sinal fraco foi detectado nas membranas de controle sem PHI-1 ou com a versão T57H de PHI-1. Estes dados sugerem que as cinases renaturadas na membrana são capazes de fosforilar substratos que também são absorvidos na membrana. O KAT-WB foi aplicado para detectar múltiplas cinases PHI-1 nos tecidos e células (figura 2B). Os extractos do esqueleto de rato, dos músculos cardíacos e das células Neuro2a foram submetidos ao ensaio KAT-WB. Em comparação com o controle no-ATP (esquerdo, superior), sinais de P-PHI-1 apareceram na blot incubada com 1 mM MgATP (direito, superior). Bandas proeminentes de P-PHI-1 foram detectadas em lisatos de células Neuro2a a 100, 60 e 49 kDa (pista 3, open arrowhead). No entanto, nenhuma faixa para P-PHI-1 foi evidente na faixa com os extratos de músculos esqueléticos e cardíacos (faixas 1 e 2). O sinal P-PHI-1 não foi melhorado pelo passo de fosforilação sem PHI – 1 (Figura 2, fundo, em branco: BLK). Estes resultados mostram que existem múltiplas cinases PHI – 1 expressas em células neuronais, mas não em músculos esqueléticos ou cardíacos. Isso nos fornece uma ferramenta poderosa para detectar múltiplas cinases específicas de substrato em células e tecidos. Uma nota técnica é que a renaturação overnight com PHI-1 foi necessária para a detecção dos sinais de fosforilação, e que uma maior concentração de PHI-1 não aumentou a intensidade de coloração (não mostrado).

com base nestes dados, propomos que o KAT-WB seja capaz de detectar a autofosforilação de Tir cinases e a fosforilação específica do local de proteínas de substrato selectivas de interesse por múltiplas cinases proteicas presentes nos tecidos e células. O KAT-WB partilha essencialmente as vantagens do tradicional ensaio de fosforilação em gel, que detecta as actividades da cinase numa mistura bruta, tais como extractos celulares, expondo as suas dimensões moleculares . Outra vantagem destes dois ensaios é que as modificações pós-translacionais (PTMs) das cinases nas células podem ser preservadas em um ponto de tempo desejado em condições específicas, porque as amostras para estes ensaios são rapidamente desnaturadas com o tampão, incluindo SDS, eliminando fosforilação e desphoforilação nos extratos . A maioria das cinases proteicas são reguladas através de PTM. O KAT-WB é capaz de monitorar as flutuações nas atividades cinase, mesmo que PTMs regulatórios ainda não tenham sido caracterizados. KAT-WB é incapaz de detectar cada cinase em extratos de células porque apenas enzimas monoméricas que se renaturam eficazmente sob as condições empregadas mostram atividade. No entanto, as modificações do KAT-WB devem ser capazes de detectar cinases reguladas pela calmodulina e ciclinas, tal como foi feito através do ensaio de fosforilação em gel . A melhoria da eficiência de renaturação e uma combinação com imunoprecipitação/imunodepleção com anticorpos para cinases podem expandir a utilidade da abordagem.

é digno de nota que, além da fosforilação, o princípio do protocolo KAT-WB pode ser aplicado para a detecção de outras enzimas PTM, tais como acetilases, metilases e ligases ubiquitinas, quando anticorpos PTM específicos estão disponíveis. Juntamente com o desenvolvimento de anticorpos que reconhecem PTMs específicos do local, metas de pesquisa cobertas por atividade marcada western blotting será expandida.