é crucial ter o controlo do título viral no trabalho experimental com vírus. A fim de facilitar as comparações entre os estudos realizados em diferentes laboratórios, é desejável a utilização de métodos normalizados harmonizados. Para o herpesvírus humano 6 (HHV-6) , Um β-herpesvírus a que a maioria das pessoas foram expostas , o método da dose de infecciosidade da cultura de tecidos de 50% (TCID50) é frequentemente utilizado para a avaliação do título viral. Uma leitura comum é a inspecção ocular dos efeitos citopáticos (EPC), ou seja, o aumento das células infectadas . Um obstáculo com esta abordagem é que as células podem aumentar mesmo quando não infectadas. É especialmente difícil no limite da infecção na série de titulação’ como as células aumentadas devido à infecção tendem a aumentar menos com o aumento da diluição do vírus (ficheiro adicional 1: Figura S1). O ensaio de imunofluorescência (IFA) é uma abordagem alternativa de leitura para a inspecção ocular na avaliação TCID50 ou para o cálculo de unidades infecciosas, ou seja, a fracção de células infectadas . A leitura baseada em IFA é mais distinta na discriminação de células infectadas não infectadas, mas a coloração é trabalhosa e um número substancial de células precisam ser contadas para obter valores confiáveis. A monitorização de células individuais implica um risco de interpretar mal a positividade de uma célula, uma desvantagem tanto da inspecção ocular como da leitura baseada em IFA. Assim, desenvolvemos e validámos uma abordagem alternativa de leitura de TCID50, onde o aumento da carga viral de ADN é medido em cada poço de titulação de placas de cultura TCID50 utilizando PCR quantitativo em tempo real (Q-PCR). Esta abordagem foi comparada com a inspecção ocular e a leitura IFA do TCID50, e com a abordagem das unidades infecciosas acima descrita.
HHV-6A (GS deformação) foi propagado nas células-T, a linha de HSB-2 em GlutaMAX contendo RPMI 1640 médio (Invitrogen, Reino Unido) suplementado com 10% de soro bovino fetal (HyClone, UT), 100 U/ml de penicilina e 100 µg/ml de estreptomicina (Invitrogen). Quando aproximadamente 50% das células vivas tinham aumentado, o sobrenadante foi colhido e congelado imediatamente em alíquotas a -80°C até à análise. Como controlos, sobrenadante do vírus da passagem 17 (P17) foi inactivado à luz UV durante 20 minutos ou com tratamento térmico a 56°C durante 1 h. A replicação HHV-6A em células HSB-2 foi seguida durante dez dias usando Q-PCR (Applied Biosystems, Reino Unido), como descrito anteriormente . Antes da análise Q-PCR, o DNA foi extraído das suspensões celulares usando um kit baseado em placas de 96 alvéolos, de acordo com o protocolo do fabricante (Magmax-96 Viral RNA Isolation Kit, Applied Biosystems). Para avaliar o teor de ADN HHV-6A nos lotes virais, a Q-PCR foi realizada como descrito acima, após extracção do ADN, utilizando colunas de filtro (QIAGEN GmbH, Alemanha).
para configurar as placas de cultura TCID50, as suspensões de células de 40 µl 104 HSB – 2 por alvéolo foram semeadas em placas de cultura de 96 poços de fundo redondo. As células foram inoculadas durante 3-4 horas com 160 µl de diluições cinco vezes superiores de sobrenadante HHV-6A, seis replicados por diluição. Controles Mock e médio foram incluídos em poços triplicados em todas as placas. As células foram lavadas uma vez antes de 50-70 µl de suspensão celular serem amostradas de cada poço e armazenadas a -80°C como amostras de zero dia após a infecção (PPP). As suspensões celulares restantes foram incubadas durante sete dias a 37 ° C. A sete ppp, a placa descongelada de dpi zero e as sete placas de dpi foram submetidas à extração de DNA usando o kit baseado em contas descrito acima. Posteriormente, o ADN viral foi quantificado por Q-PCR, tal como acima descrito.
Para IFA as células foram fixadas em lâminas de vidro com uma escala de 1:1 mistura de acetona e metanol a -20°C por 10 minutos, bloqueado, com 5% de soro de cabra e de 3% BSA em PBS, e manchado com um primário monoclonal de rato de anticorpos específicos para o HHV-6 glicoproteína gp116/54/64 (Advanced Biotechnologies, MD). A coloração foi visualizada por uma IgG anti-rato cabra conjugada Alexa 633 (Invitrogen). A coloração com 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (Vector laboratories, CA) foi usada para visualizar os núcleos celulares. As folhas de cobertura foram montadas com suportes de montagem (DAKO A/S, Dinamarca), e as lâminas foram analisadas usando um microscópio confocal (Leica Microsystems, Alemanha). A fracção de células infectadas foi determinada por contagem manual. Se ≥1/3 das células contiverem proteínas virais, foram contadas ≥25 células por poço e se <1/3 das células contiverem proteínas virais, foram contadas ≥100 células por Poço. Poços em que ≥2% das células com manchas positivas foram considerados infectados. O nível de aumento da carga viral de DNA em cada poço foi correlacionado com a coloração da IFA construindo uma fórmula no Software Excel (Microsoft, WA). Esta fórmula pergunta se o DNA viral em um certo poço na placa TCID50 mudou um certo número de vezes que é definido, e se o mesmo poço foi positivo em IFA ou não.
para comparações com a leitura Q-PCR, todas as placas TCID50 foram avaliadas por inspeção ocular utilizando um microscópio de contraste de fase por dois inspetores independentes (TCID50 ocular). Wells foram considerados infectados se pelo menos uma célula ampliada foi encontrada. Para ambas as aproximações de leitura, o TCID50 foi calculado de acordo com a fórmula de Reed e Muench .
os resultados do TCID50 determinados pelo Q-PCR (Q-PCR TCID50) foram comparados com a avaliação das unidades infecciosas pelo IFA (comunicação pessoal com Louis Flamand) em três pontos temporais para o P19 e um para o P27. Brevemente, 2,5 * 105 células HSB-2 foram inoculadas como descrito acima com várias diluições de vírus em poços triplicados para cada diluição. Em dois PPP, as células foram submetidas ao IFA visando a proteína viral inicial p41 (clone 9A5D12, Santa Cruz Biotech. Inc., CA) como descrito acima. O título viral, expresso em unidades infecciosas por ml, foi calculado multiplicando a fracção de células infectadas pelo número total de células a zero PPP e factores de diluição.
para determinar o tempo ideal para as medições do aumento da carga viral de ADN, seguiu-se a replicação do vírus durante dez dias. Foram necessários sete dias para alcançar um aumento suficiente do ADN viral (Figura 1) e, portanto, foi escolhido como o ponto de tempo da colheita. Para definir o ponto de corte do aumento relativo do ADN viral correspondente à infecção positiva, o aumento da carga viral do ADN foi correlacionado com a expressão da proteína viral. O IFA foi realizado a sete PPP em células de cada poço em três placas TCID50 para dois lotes de vírus diferentes. O ponto de corte Ideal foi encontrado para ser um aumento de dez vezes no DNA viral, onde a correlação com a expressão proteica foi observada em 93% dos poços (Figura 2).
replicação de HHV-6A (estirpe GS) seguida de Q-PCR. Os dados apresentados são os resultados médios (± SEM) das culturas triplicadas para cada multiplicidade de infecções (MOI). As linhas de ligação interrompem-se quando a carga viral de ADN caiu abaixo do limite de detecção.
Determinação de corte de ponto para a infecção. O ponto de corte ideal para a infecção foi encontrado para ser um aumento de dez vezes, onde a correlação com a expressão proteica foi observada em 93% dos poços pelo IFA com um anticorpo visando a proteína viral tardia gp116/54/64. Nenhuma proteína viral bem contida onde a carga viral de ADN não tinha aumentado dez vezes. Os dados apresentados são os resultados médios (± SEM) de três chapas DICC50.
Comparando-se os valores de Q-PCR TCID50 ocular e IFA TCID50, um Q-PCR TCID50 igualado 1.41 ocular e 1.03 IFA TCID50 com base em 13 ou 5 avaliações, respectivamente. Q-PCR TCID50 não deu valores estatisticamente diferentes em comparação com TCID50 ocular ou IFA (p = 0, 41 ou p = 0, 29 respectivamente) (teste t emparelhado) (Quadro 1).
DNA Viral copiar números são muitas vezes usados como uma estimativa aproximada da quantidade de partículas virais um determinado viral lote contém. No entanto, é incerto o quão bem isso corresponde à infecciosidade. Para avaliar este facto, os valores de TCID50 foram comparados com os números de cópias de ADN viral para o respectivo lote. As razões médias da carga de ADN viral para os valores de TCID50 Q-PCR nos lotes de vírus foram semelhantes para P17 e P19; 6, 3*105 e 2, 0*106 cópias de ADN viral por TCID50, respectivamente. No entanto, para o P21, a razão foi consideravelmente mais elevada, 1, 3*108 cópias de ADN viral por TCID50 (Tabela 1). Assim, a medição do ADN viral nos sobrenadantes do lote é insuficiente para atribuir correctamente a infecciosidade de um lote, pelo que devem ser efectuados ensaios biológicos para determinar com precisão os títulos virais.
o coeficiente médio de variação intra-ensaio (CV) para Q-PCR TCID50 foi de 9%, determinado por extrações paralelas duplicadas e Q-PCRs de três placas de cultura TCID50. Para o TCID50 ocular, o CV intra-ensaio foi de 45%, determinado por um total de doze placas de cultura TCID50 lidas por dois avaliadores independentes. O CV intra-ensaio foi de 14% para o IFA TCID50, determinado por duas manchas paralelas de células a partir de duas séries. Para as unidades infecciosas que se aproximaram, o CV intra-ensaio foi de 43% determinado por quatro manchas paralelas de células a partir de uma corrida. O CV médio inter-ensaio foi de 73% para Q-PCR TCID50 e 66% para TCID50 ocular, determinado para três lotes de vírus rodados cinco, três e três vezes, respectivamente. Para o IFA TCID50, o CV inter-ensaio foi de 25%, determinado para uma execução por lote três vezes. Para as unidades infecciosas que se aproximam, o CV inter-ensaio foi de 77%, determinado por três ensaios separados para um lote.
em resumo, o método Q-PCR TCID50 descrito aqui correlaciona-se bem com a expressão de proteínas virais e, portanto, tem elevada especificidade para a dose infecciosa. É mais robusto do que o TCID50 ocular, o TCID50 IFA e a abordagem das unidades infecciosas, com base nos valores CV intra-ensaio. O CV intra-ensaio é neste contexto uma medida da precisão de uma determinada abordagem de leitura e, por conseguinte, é o valor mais exacto para as comparações dos diferentes métodos. Para adaptar o método, é necessário determinar o ponto de corte para cada estirpe viral testada e para cada linha celular utilizada. A abordagem de leitura Q-PCR é mais trabalhosa do que a inspecção ocular, mas, na nossa opinião, consideravelmente menos trabalhosa do que a IFA TCID50 e a abordagem das unidades infecciosas. É mais caro em termos de recursos laboratoriais do que a inspecção ocular, IFA TCID50 e a abordagem das unidades infecciosas. No entanto, nossos dados enfatizam a importância de realizar testes biológicos para determinar com precisão títulos virais, o que pode justificar o custo e mão de obra. Além disso, uma melhor normalização dos métodos de avaliação dos títulos virais utilizados no campo HHV-6 poderá aumentar a concordância entre os diferentes estudos.