Onkologirapporter

introduktion

lungcancer är en malign tumör med högstmorbiditet och dödlighet över hela världen, och dess förekomst ökar. Cirka 80% av sjukdomen kan tillskrivasicke – småcellig lungcancer (NSCLC) (1). På grund av begränsningarna i tidigtdiagnostiska tekniker och bristen på tidiga specifika kliniskamanifestationer diagnostiseras 70-80% av patienterna i avancerade stadier(2). Därför är identifiering av asafe och effektiv läkemedelsbehandling för NSCLC avgörande.

nya fynd har visat att förekomsten,utvecklingen och överföringen av NSCLC inte bara påverkas avgenetiska faktorer, men att epigenetisk förändring också är viktig,inklusive liten molekyl icke-kodande RNA (ncRNA) (3). MikroRNA (miRNA), en klass av endogenliten ncRNA med en längd av ~21-25 baser, allmänt existerande ineukaryoter, kan identifiera mRNA för en specifik målgen(4). Över 50% av miRNA-generna kartläggs i NSCLC-relaterade bräckliga platser eller genomiska regioner,vilket tyder på att miRNA-uttryck kan vara nära associerat mednsclc. Som rapporterats, uttrycket av ett stort antal miRNAs inNSCLC visar störning och obalansen av miRNAs främjar framsteg av NSCLC-cellcykel, anti-apoptotisk effekt, förbättradecellinvasion och metastas av icke-småcellig lungcancer(5).

PI3K/Akt-signalvägen spelar en viktig roll i tillväxtfaktormedierad cellöverlevnad. Tidigare upptäckterhar visat att störningen i PI3K/Akt/mTOR-vägen kan spelaen viktig roll vid bildandet av NSCLC (6). Det har också rapporterats att cellproliferationssignalen genererad genom kombinationen av ett antaltransmembranreceptorer och ligander kan aktivera signaltransduktion av PI3K/Akt/mTOR, som är nära associerad mednsclc proliferation och överlevnadsstatus (7). Dessa receptorer inkluderar c-met, epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR), c-kit och insulinliknande tillväxtfaktorreceptor (IGF-IR).

Curcumin är en naturlig aktiv ingrediens extraheradfrån torr rhizom av gurkmeja Curcuma släktet växt, gurkmeja ochcurcuma, med omfattande farmakologiska effekter, låg toxicitet och god tolerans, och på grund av dess ekonomiska värde har det blivit en hotspot för utforskning (8). Fynd av studier med fokus på curcumin har identifierat ett brett spektrum avFarmakologiska aktiviteter såsom anti-inflammation,anti-oxidation, lipid, anti-virus, Anti-infektion, cancer mot cancer,antikoagulant, Anti-leverfibros och ateroskleros, lågtoxicitet och få biverkningar (9-13).Effekten av curcumin på NSCLC och den underliggande molekylära mekanismen förblir dock oklar. I den aktuella studien undersökte vi anticancereffekten av curcumin på cellproliferationoch apoptos av human NSCLC och identifierade ett möjligt förhållande mellan denna effekt och miRNA-192-5p-modulerad PI3K/Aktsignaleringsväg.

material och metoder

kemikalier

dulbeccos modifierade Eagle ’ s medium (DMEM) och fetalcalf serum (FBS) köptes från Gibco (Carlsbad, CA, USA) och(Sydamerika). 3-(4,5-dimetyl-thyltiazol-2-yl)-2,5 difenyltetrazoliumbromid(MTT) köptes från Sangon Biotech (Shanghai, Kina). Apoptosis Detection kit jag köptes frånbd Biosciences (San Jose, CA, USA). Caspase – 3 activity assaykit köptes från Promega (Madison, WI, USA).

cellkultur

Human normal NCL-H460 och BEAS-2e lungepitelialceller och humana a549 lungcancerceller erhölls från CellResource Center i det andra militära medicinska universitetet. Dessaceller odlades i DMEM kompletterat med 10% FBS (båda frångibco), 100 U/ml penicillin och 100 oc/ml streptomycin vid37 oc C och en fuktighetsinkubator med 5% CO2. Dekoncentrationer (5,10,20 och 40 kg) och tidsperioder (12 och 24 timmar) curcumin mot a549-celler undersöktes. Den kemiska strukturen av curcumin visas i Fig.1.

cellviabilitetsanalys

celler såddes vid en densitet AV5 103/brunn i 96-brunnsplattor. Kortfattat, cellviabilitetmättes genom MTT-analys (Sangon Biotech). Tio mikroliter MTT (5mg/l) tillsattes i varje brunn och inkuberades för 4 h vid 37 kcal C i ahumidifierad inkubator med 5% CO2. Dimetylsulfoxid (150; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) tillsattes till varje brunn och omrördes i 20 minuter vid rumstemperatur. Absorbansen mättes vid 450 nM med användning av amicroplate reader.

Annexin V-FITC/propidiumjodid (PI)apoptosanalys

celler såddes med en densitet AV1 106/106-brunnsplattor. Odlade celler tvättades två gånger med iskall PBS och färgades sedan med Annexin V-FITC och PIusing Apoptosis Detection kit i enligt tillverkarens instruktioner (BD Biosciences). Apoptos analyserades via flowcytometric med CellQuest Pro (IVD) programvara (båda från BDBiosciences).

caspase-3 aktiveringsanalys

celler såddes vid en densitet AV5 103/brunn i 96-brunnsplattor. Caspase – 3-aktivitet mättes med hjälp av ett caspase-3-aktivitetsanalyssats enligt tillverkarens instruktioner (Promega). Ett hundra mikrolitersreaktionsbuffert med 10 oc-l substrat asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-p-nitroanilin (pNA) tillsattes till 10 oc-l proteincelllysat/brunn och inkuberades vid 37 oc C för 6 h. Caspase-3-aktivitetanalyserades vid en absorbans av 405 nm.

celltransfektion

miR-192-5p, anti-miR-192-5p och negativ kontrollmimik (miR-NC) köptes alla från Sangon Biotech. Cellernafröades i 6-brunnsplattor och odlades till 50-60% sammanflöde priorto transfektion. Mimikerna transfekterades med Lipofectamine2000 i celler enligt tillverkarens instruktioner(Invitrogen Life Technologies). Gen eller protein isolerades 24 hafter transfektion och användes för omvänd transkription-kvantitativpolymeraskedjereaktion (RT-qPCR) respektive western blot-analys.

RT-qPCR

celler såddes vid en densitet AV5 103/brunn i 96-brunnsplattor. Totalt RNA extraherades från cellerna med användning av Trizolreagens (Invitrogen Life Technologies).Koncentrations-RNA bestämdes med användning av en nanodrop db nd – 1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, USA). Kvantifiering av miRNAs utfördes avett TaqMan miRNA-analyssats (Applied Biosystems, Foster City, CA,USA). Totalt RNA utsattes för cDNA-syntes i första strängen ochundersöktes med användning av ett Primscript RT-reagenssats (både från Takara,Shiga, Japan). qPCR utfördes med SYBR-grön PCR Master Mix (Takara) på ABI 7500HT-systemet. De primers som används däråtgärder visas i tabell I.

tabell i de PCR-primrar som används däråtgärder.

Western blot-analys

celler såddes vid en densitet AV5 103/brunn i 96-brunnsplattor. Odlade celler tvättadestvå gånger med iskall PBS och inkuberades med iskall lysbufferför 30 min på is. Cellvätska uppsamlades och centrifugerades vid12, 000 kg i 10 minuter vid 4 C. Den lösliga proteinkoncentrationen varbestämd med användning av ett BCA-proteinanalyssats (Sigma, St.Louis, MO,USA). Totala proteiner (10 occurg) kördes på 12% natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgeler och överfördes till polyvinylidendifluorid (PVDF) membran. Membranen blockerades medtrisbuffrad saltlösning (TBS) innehållande 5% fettfri mjölk för att blockera icke-specifika bindningsställen. Membranen inkuberades medanti-PI3K (1:1500) och anti-Akt (1: 1000) (båda från Santa CruzBiotechnology, Inc.(1: 500; Sangon Biotech) över natten vid 4 msk C. Efter att ha tvättats med 1% Tween-20 / PBS inkuberades membranen med sekundärenantikroppar (Tiangen, Peking, Kina) för 2 h vid rumstemperatur.Proteinerna detekterades med användning av förbättrad kemiluminescens (Vilber, Marne La Vallubbize, Frankrike).

statistisk analys

statistiska analyser utfördes med hjälp av SPSS 19.0 programvara. Resultaten presenteras som medelvärde för SD. Resultaten analyserades med hjälp av studentens t-test eller envägs variansanalys(ANOVA). P< 0,05 ansågs statistiskt signifikant.

resultat

Curcumin hämmar viabiliteten hos a549celler

koncentrationerna (5, 10, 20 och 40 kg) och tidsperioder (12, 24 eller 36 timmar) av curcumin mot a549-celler utvärderades med hjälp av MTT-analysen. Fig.2 visar att behandlingen av a549-celler för 12, 24 eller 48 hmed 10, 20 och 40 occumin curcumin hämmade cellviabilitet i ados – och tidsberoende sätt. MTT-analysen indikerade attcurcumin (20 och 40 occurm) behandling för 24 eller 36 h resulterade i obetydlig cellviabilitet jämfört med kontrollgruppen(Fig. 2).

Curcumin inducerar apoptos av A549celler

före behandlingen mättes också den apoptotiska frekvensen avkurkuminbehandlade (10, 20 eller 40 oc.m.) a549-celler. Efter behandling med 20 eller 40 KGM curcumin för24 h, den apoptotiska hastigheten ökade markant i en dosberoende metod jämfört med kontrollgruppen (Fig. 3).

Curcumin inducerar caspase – 3-aktivitet ava549-celler

för att bestämma om curcumin inducerar caspase-3-aktivitet hos a549-celler mättes caspase-3-aktivitet med acaspas-3-aktivitetsanalyssats. Caspase-3-aktiviteten ökade ocksåsignifikant på ett dosberoende sätt efter curcumin (20 eller 40 kg) behandling i 24 timmar jämfört med kontrollgruppen(Fig. 4). Dessa resultat indikeradeatt curcumin inducerade apoptos i a549-celler.

miR-192-5p hämmar cellviabilitet ochinducerar apoptos av a549-celler

för att undersöka uttrycket och betydelsen avmir-192-5P i humana normala lungepitel-och lungcancerceller detekterades det relativa uttrycket miR-192-5p med användning av RT-qPCR.Fig. 5A visar att miR-192-5prelativt uttryck av NCL-H460-celler var relativt lägre, det av a549-celler var högre, med Beas-2e-celler som är de mest uttryckta.

för att analysera om miR-192-5p påverkade cellviabilitet och apoptos av a549-celler transfekterade vi miR-192-5pmimics till A549-celler. Cellerna transfekterade med miR-192-5pmimics visade en signifikant, 120-faldig ökning i miR-192-5pexpression efter 48 h transfektion, jämfört med kontroll ormiR-NC-gruppen (Fig. 5B).Överuttryck av miR-192-5p minskade livskraften hos a549-celler jämfört med kontroll-eller miR-NC-gruppen (Fig. 5C). Överuttryck avmir-192-5p inducerade emellertid den apoptotiska hastigheten för a549-celler, jämfört med kontroll-eller miR-NC-gruppen (Fig.5D).

hämning av miR-192-5p undertrycker cellviability och inducerar apoptos av a549-celler

för att bestämma huruvida anti-miR-192-5p påverkade cellviabilitet och apoptos av a549-celler, transfekteradeanti-miR-192-5p efterliknar i A549-celler. Uttrycksnivån ofmiR-192-5p detekterades med användning av RT-qPCR efter 48 h transfektion.Anti-miR-192-5p-härmar undertryckte effektivt miR-192-5prelativt uttryck av a549-celler (Fig.6A). Nedreglering av Mir-192-5p främjade cellviabilitet ochhämmade apoptotisk hastighet för a549-celler, jämfördmed kontroll-eller miR-NC-gruppen (Fig.6B och C).

Curcumin hämmar mir-192-5p geneexpression av a549-celler

för att avgöra om curcumin påverkade mir-192-5pgenuttryck av a549-celler, uttrycksnivån för miR-192-5P detekterades med RT-qPCR efter behandling med curcumin i 24 timmar. Fig. 7 visar att expressionnivån av miR-192-5p förbättrades markant av curcumin (20 eller 40 kcal).

miR-192-5p hämmar effekten avcurcumin på cellens livskraft och inducerar apoptos av a549-celler

för att undersöka hur överuttrycket av miR-192-5ppåverkade effekten av curcumin på cellens livskraft och denapoptotiska hastigheten för a549-celler, transfekterade vi miR-192-5p härmar in ia549-celler. Fig. 8 visar attcurcumin undertryckte cellens livskraft och ökade den apoptotiska frekvensen av a549-celler efter behandling med curcumin (20 oc h) för 24 timmar, jämfört med kontrollgruppen. Effekten avcurcumin (20 occurcumin) på cellviabilitet och den apoptotiska hastigheten ava549-celler minskade markant och ökade med miR-192-5pmimics, jämfört med den curcumin-behandlade gruppen (Fig. 8A).

hämning av miR-192-5p undertrycker effekten av curcumin på cellens livskraft och inducerar apoptos av a549celler

för att undersöka hur nedreglering av miR-192-5ppåverkade effekten av curcumin på cellens livskraft och denapoptotiska hastigheten för a549-celler, transfekterade vi anti-miR-192-5p mimicsinto a549-celler . Fig. 9 visar attcurcumin undertryckte cellens livskraft och ökade den apoptotiska frekvensen av a549-celler efter behandling med curcumin (20 oc h) för 24 timmar, jämfört med kontrollgruppen. Effekten av curcumin (20 oC) på cellviabilitet och denapoptotiska hastigheten för a549-celler ökades dock markant och reducerades av anti-miR-192-5P-efterlikningar, jämfört med dencurcumin-behandlade gruppen (Fig.9A).

Curcumin hämmar PI3K / Akt-proteinuttryck av a549-celler

för att detektera om curcumin påverkade PI3K/Aktprotein-uttrycket av a549-celler, detekterades PI3K/Akt-proteinuttryck med western blot-analys efter behandling medcurcumin i 24 timmar. Fig. 10 visaratt PI3K / Akt-proteinuttrycket förbättrades markant avcurcumin (20 eller 40 kcal).

miR-192-5p riktar sig direkt mot PI3K/Akt ofA549-celler

för att undersöka hur överuttryck av miR-192-5ppåverkade PI3K/Akt-proteinuttrycket av a549-celler, wetransfected miR-192-5p efterliknar i a549-celler. Fig. 11A och B visar att curcuminundertryckte PI3K / Akt-proteinuttrycken hos a549-celler efter behandling med curcumin (20 kcal) i 24 timmar, jämfört med kontrollgruppen. Effekten av curcumin(20 occuminm) påpi3k/Akt-proteinuttryck av a549-celler reducerades uppenbarligen avmir-192-5p-efterlikningar jämfört med den curcumin-behandlade gruppen (Fig. 11C och D).

hämning av miR-192-5p ökar PI3K/Akt-uttrycket av a549-celler

för att bestämma om anti-miR-192-5p påverkade effekten av curcumin på PI3K/Akt-proteinuttryck av a549-celler, wetransfected anti-miR-192-5p efterliknar i A549-celler. Fig. 12A och B visar att curcuminundertryckte PI3K / Akt-proteinuttrycket av a549-celler efterbehandling med curcumin (20 kcal) under 24 timmar, jämfört med kontrollgruppen. Emellertid förstärktes effekten av curcumin(20 occuminm) på PI3K/Akt-proteinuttrycket av a549-celler markant av anti-miR-192-5p-efterlikningar, jämfört med den curcumin-behandlade gruppen (Fig.12C och D).

diskussion

en miljon patienter buktar för NSCLC årligenöver hela världen, och förekomsten av NSCLC ökar gradvis.Även om ett antal studier under de senaste åren har fokuserat på NSCLC, har inga stora framsteg gjorts när det gäller behandling. Kirurgiär fortfarande den mest effektiva behandlingsmetoden, men när det gällerförebyggande såväl som för patogenesen av NSCLC ytterligare studiermåste genomföras (14,15). Nyligen identifierade Liu et al att curcumin hämmar proliferation och signifikant inducerar cell apoptotisk hastighet av gastriska cancerceller (16). Ma et al visade attcurcumin hämmar celltillväxt och invasion av bukspottkörtelcancerceller (17). Sammantaget indikerade ourfindings att curcumin undertryckte cellviabilitet, inducerad cell apoptos och ökade caspase-3-aktiviteten hos a549-celler.Därför är curcumin ett potentiellt läkemedel för onkoterapi.

miRNA är en klass av RNA med liten molekyl som har en mycket viktig roll i genuttrycksreglering som nyligen identifierades (18). miRNA gener ärvanligtvis belägna i intron segment av genen. Mirna är emellertid också distribuerade utanför icke-kodande exoner av genen och denintergena regionen, som har visat sig delta i avariety av kända onc-ogena vägar, såsom p53, Bcl-2 och K-Ras(19). Det har visats att>50% av definierade humana Mirna finns i genomets bräckliga platser och dessa bräckliga platser är ofta förknippade med förekomsten av NSCLC (20). Uttrycksprofilerna för Mirna är förknippade med utvecklingen av NSCLC. miR-34C, miR-145 och miR-142 kan hämma NSCLC (5). Resultaten av den föreliggande studienindikerar att mir-192-5p relativt uttryck av NCL-H460-celler varrelativt lågt, det för a549-celler var högre, med BEAS-2e-celler som var mest uttryckta. Överuttryck av miR-192-5pminskade cellens livskraft och ökade den apoptotiska hastigheten ava549-celler. Nedreglering av miR-192-5p ökade cellviabiliteten och minskade den apoptotiska hastigheten för a549-celler.Dessutom hämmade curcumin mir-192-5p-genuttryck av A549celler. Uppregleringen av Mir-192-5p-uttryck förbättradeffekten av curcumin på cellens livskraft och den apoptotiska hastigheten ava549-celler, medan nedregleringen av miR-192-5p-expressionreversed effekten av curcumin på a549-celler. Våra resultat varkonsekvent med andra studier. Till exempel rapporterade Ye etal att curcumin främjar cellapoptos genom att aktiveramir-192-5p (21). De sannolika mekanismerna för hur curcumin påverkar miR-192-5uttryck är dock oklara och framtida studier för att bestämma denna effektbör utföras.

under de senaste åren har effekten av PI3K/Aktsignaleringsvägen på mänsklig NSCLC fått mycket uppmärksamhet(22). Aktivering av PI3K / Aktsignaleringsvägen är mycket vanlig i human NSCLC, vilket kan främjaförekomsten av cancer genom en mängd olika mekanismer, inklusivegenmutationer, reduktion av cancersuppressorgen PTENexpression, PI3K-mutation eller amplifiering, Akt-mutation ellerförstärkning och onkogenreceptoraktivering (7). Aktivering av varje komponent i denna väg är den främsta orsaken till den ogynnsamma prognosen för NSCLC, vilket kan leda till läkemedelsresistens av behandlingen, vilket hämmande av denna väg kan vända läkemedelsresistens och förbättrakemoterapi och strålningseffekter in vivo (23). De data som erhållits i nutidenstudie avslöjade att curcumin undertryckte PI3K/Akt-proteinuttrycket av a549-celler. Uppreglering av Mir-192-5p-expressionavstod PI3K/Akt-proteinuttrycket av a549-celler.Nedreglering av Mir-192-5p-uttryck kan öka PI3K/Aktprotein-uttrycket för a549-celler. Xu et al har demonstreratatt curcumin hämmar invasionen och migrationen av FTC133 cellvia nedreglering av PI3K/Akt-signalvägen i sköldkörtelcancerceller (24). Xu et föreslog också att curcumin hämmar tumörproliferation av lungcancergenom PI3K / Akt-vägen (25).Schee et al avslöjade att miR-22-3p, miR-143-3p andmiR-192-5p reglerade och var involverade i APC, TGF-exporten och Pi3kpathway i kolorektala cancerceller (26).

Sammanfattningsvis fokuserade denna studie på effekten avcurcumin mot a549-celler, inhiberad cellproliferation ochinducerad apoptos av human NSCLC genom uppreglering avmir-192-5p och undertryckande av PI3K/Akt-signalvägen. Slutsatserna från den aktuella studien indikerar att curcumin är ett potentiellt mål vid behandling av NSCLC. Föreliggande studie avslöjade dock vissa begränsningar eftersom vi inte undersökte det detaljerade förhållandet mellan miR-192-5p och PI3K/Akt-vägen i lungcancerceller. Ytterligare studier in vivo, kliniska ochstorskaliga statistiska analyser av föreliggande studie ska utföras för att verifiera resultaten.