PMC

Pseudomonas aeruginosa je všudypřítomné environmentální gram-negativní bakterie se nachází v půdě a vodě. Je to také oportunní patogen, který způsobuje infekce u jedinců s vrozenými imunitními defekty, včetně pacientů s cystickou fibrózou (CF) (8). P. aeruginosa se setkává s prostředím s nízkým obsahem kyslíku v půdě a ve vodě. Důkazy naznačují, že u lidí s CF se bakterií může, alespoň z části, být v prostředí s nízkým obsahem kyslíku v mukopurulentní masy nebo biofilmy v rámci dýchacích cest (19). P. aeruginosa je schopen růst anaerobně za přítomnosti terminální elektronové akceptory, např. dusičnan (NO3−), dusitanů (NO2−), a oxidu dusného (N2O), nebo když l-arginin je substrátem pro růst (21). Hlen CF dýchacích cest je dostatečně bohatý na NO3 – a NO2-na podporu anaerobního růstu P. aeruginosa (7, 19). V této studii bylo provedeno srovnání proteomu P. aeruginosa během růstu v přítomnosti a nepřítomnosti kyslíku.

P. kmen aeruginosa PAO1 získaný od Steve Lory (Harvard Medical School, Boston, MA) byl pěstován ve 125 ml baňkách v Luria vývaru (LB) doplněném 1% KNO3 s třepáním při 200 ot / min při 37°C pro aerobní růst. Anaerobní růst byl dokončen, jak bylo popsáno výše (9) v 80 ml média ve 100 ml lahvičkách s Wheatonovým sérem (Fisher Scientific) s gumovými zátkami. Médium bylo zbaveno kyslíku tím, že bylo vystaveno probublávání plynem N2 po dobu 1 hodiny. Jak pro aerobní a anaerobní podmínky, bakterie byly sklizeny v pozdní logaritmické fáze růstu, na kterém místě cell density (optická hustota při 600 nm) anaerobní kultury bylo 44% hustota aerobní kultury. Nebyl zjištěn žádný významný rozdíl mezi pH sklizených kultur (pH 7,6 pro anaerobní kulturu a pH 7,4 pro aerobní kulturu). Stejné množství denaturovaného a redukovaného celobuněčného proteinu (2 .0 mg z každého růst státu), byly označeny buď světlo (12C) nebo těžké (13C) štěpitelné izotopy-coded affinity tag (ICAT) činidla (Applied Biosystems, Foster City, CA), zpracovány a analyzovány jak bylo popsáno dříve (3). Hlášená data jsou průměry nejméně dvou nezávislých experimentů.

šest set deset proteinů P. aeruginosa bylo identifikováno a kvantifikováno pomocí ICAT (úplný seznam proteinů viz tabulka S1 v doplňkovém materiálu). Mezi 151 proteiny, jejichž hojnost se změnila během anaerobního růstu, 76 bylo vyšší v hojnosti (Tabulka (Tabulka 1) 1) a 75 bylo v hojnosti nižší (tabulka (Tabulka2).2). Jak se dalo očekávat, 13 proteinů, které se podílejí na anaerobní růst a denitrifikace (včetně výrobků z nir, nos, a nar geny) byly vyjádřeny na vyšších úrovních během anaerobní růst (Tabulky (Tabulka1).1). Tyto výsledky naznačují, že pozorované změny obsahu bílkovin zahrnují změny vyplývající konkrétně z růstu při různých hladinách kyslíku.

změny v detekována proteomu může také odrážet rozdíly ve všech hustoty-závisí nařízení kromě účinků kyslíku napětí, vzhledem k nižší relativní hustota buněk sklizených anaerobní kultury. Vskutku, 29 bílkoviny zjištěné v nižší hojnosti v anaerobně pěstovaných buněk jsou kódovány geny v minulosti ukázal jako quorum sensing indukované (5, 16, 17). Patří sem podjednotky kyanovodíkové syntázy HcnB a HcnC; Pseudomonas chinolon signalizuje biosyntetické enzymy PqsB, PqsC a PqsD; a PhnB (tabulka (Table2).2). V souladu s našimi výsledky, hcn a pqs geny byly nalezeny také být transkripčně potlačené během anaerobní růst podle posledních DNA microarray analýzy pomocí aerobní a anaerobní kultury sklizeny ve stejné hustoty buněk (1) (Tabulky (Table22).

k identifikaci vylučovaného P. proteiny aeruginosa se změněnými hladinami během anaerobního růstu byly supernatantní proteiny kultury koncentrovány (11)a odděleny elektroforézou dodecylsulfát-polyakrylamidový gel (SDS-PAGE) (obr. (Obr.1).1). Byly identifikovány a analyzovány čtyři proteinové pásy obarvené Coomassiem, odpovídající diferencovaně exprimovaným proteinům, jako v předchozí studii (4) (obr. (Obr.1).1). Na abundances tří vylučované proteiny se objevil ke snížení během anaerobní růst: CbpD chitin-vázající protein, LasB elastázu, a protein neznámé funkce kódovány PA0572. Předchozí proteomické studie zjistily, že všechny tři tyto proteiny jsou indukovány snímáním kvora (11). Jeden protein se zdá být zvýšena v hojnosti během anaerobní růst a byl identifikován jako buď bičíkový vlákno proteinu FliC nebo bičíkový capping protein FliD (vzhledem k překrývání charakteristik těchto dvou proteinů).

většina proteinů vnější membrány P. aeruginosa neobsahuje zbytky cysteinu, a proto jej nelze analyzovat pomocí ICAT (4). Proto byla jako doplňková metoda (4) použita dvourozměrná (2D) stránka. Několik vnějších membránových proteinů (obr. (Obr.2) 2) byly vyříznuty z 2D gelu a identifikovány (4). OprE se zdálo, že se během anaerobního růstu zvyšuje hojnost, zatímco OprF a OprH se zdálo, že se hojnost snižuje (obr. (Obr.2).2). Všechny tři proteiny migrovaly jako více druhů během izoelektrické zaostřování (obr. (Obr.2).2). Snížil množství OprF během anaerobní růst byl potvrzen imunoblotingu z vnější membránové proteiny (data nejsou zobrazena), pomocí polyklonální anti-OprF antisérum (dárek od Robert Hancock, University of British Columbia v Vancouver, Kanada).

mezi proteiny P. aeruginosa, které vykazovaly zvýšenou hojnost během anaerobního růstu (tabulka (Tabulka1; 1; obr. Obr.1), 1), několik přispívá k funkcím podílejícím se na tvorbě a vývoji biofilmů. Tyto proteiny zahrnují protein Crc pro kontrolu katabolitů a proteiny motility záškuby PilU, PilG a ChpA (12, 13, 18). V souladu se zvýšenou úrovní Crc v anaerobně pěstované buňky (Tabulky (Tabulka1),1), známý cíle Crc represe byly sníženy v hojnosti (Tabulce (Tabulka2),2), včetně hmgA a bkd genových produktů (6, 10). ChpA a PilG jsou součástí komplexního regulačního systému kontrolujícího motilitu záškubů (18). Celkově tyto výsledky naznačují, že exprese nebo funkce přídavků buněčného povrchu, které ovlivňují tvorbu biofilmu, se během anaerobního růstu mění. Tyto změny mohou přispět ke zvýšené tvorbě biofilmu pozorované u p.aeruginosa rostoucího anaerobně (20).

kromě změn ve vnějších membránových proteinů pozorovány při anaerobní růst, ICAT analýza ukázala, že několik enzymů podílejících se na biosyntéze P. aeruginosa lipopolysacharid (LPS) byly vyjádřeny na vyšších úrovních během anaerobní růst (Tabulky (Tabulka1).1). Jednalo se o homolog beta-hydroxylázy LpxO2, které hydroxylates lipidů A mastných kyselin (14); LPS core heptosyltransferases WaaC a WaaF (2, 15); a WbpG, která je kódována genem clusteru, který se podílí na syntéze dlouhé B-band O antigen. Tyto výsledky naznačují, že obsah LPS by mohl být změněn v důsledku anaerobiózy.

stručně řečeno, proteom P. aeruginosa se během anaerobního růstu významně mění. Identifikovali jsme celkem 617 proteinů: 610 analýzou ICAT, 4 analýzou SDS a 3 analýzou 2D stránek. Z 617 identifikovány proteiny, abundances 158 pohybovala mezi pěstovány anaerobně i aerobně pěstované buňky. Protože P. aeruginosa dosáhl nižší hustoty buněk v rámci našich anaerobních růstových podmínek, než za aerobních podmínek růstu, hustoty závislé změny v expresi bílkovin, mohou přispět k proteomu, které jsme zjistili během anaerobní růst. Nicméně hustota bakteriálních buněk bude pravděpodobně podobně omezená v mnoha environmentálních výklencích, kde je více živin (včetně kyslíku) vzácné. Změny hladin bílkovin, které jsme zjistili, proto přispívají k pochopení toho, jak se proteom a metabolický stav bakterií liší v reakci na různá prostředí. Přímá analýza obsahu bakteriálních bílkovin je robustní technologie pro pozorování adaptace bakterií na specifické environmentální výklenky, včetně dýchacích cest CF.