Las proteínas quinasas son la superfamilia enzimática más grande involucrada en la transducción de señales celulares y representan objetivos terapéuticos para una variedad de enfermedades. Ha habido esfuerzos intensivos de muchos laboratorios para comprender sus mecanismos catalíticos, descubrir inhibidores y discernir sus funciones celulares. En esta revisión, describiremos dos enfoques desarrollados para analizar las proteínas quinasas: inhibición analógica del bisustrato y utilización analógica del fosfonato. Ambos métodos se han utilizado en combinación con el método de semisíntesis de proteínas de ligadura de proteínas expresada para avanzar en nuestra comprensión de las interacciones entre la quinasa y el sustrato y la elucidación funcional de la fosforilación. El trabajo previo sobre la naturaleza del mecanismo de la proteína quinasa sugiere que sigue un estado de transición disociativo. Se diseñó un análogo de bisubstrato contra la quinasa del receptor de insulina para imitar la geometría de una distancia de coordenadas de reacción de estado de transición disociativo. Este compuesto de bisubstrato demostró ser un inhibidor potente contra la quinasa del receptor de insulina y ocupó los sitios de unión de péptidos y nucleótidos. Los compuestos de bisubstrato con potencial de enlace de hidrógeno alterado, así como los espaciadores variables entre la adenina y el péptido, demuestran la importancia de las características de diseño originales. También hemos demostrado que los análogos del bisustrato relacionados se pueden utilizar para bloquear potentemente las serinas / treonina quinasas, incluida la proteína quinasa A. Dado que muchas proteínas quinasas reconocen sustratos de proteínas plegadas para una fosforilación eficiente, era ventajoso incorporar los conjugados péptido-ATP en estructuras proteicas. Utilizando la ligadura de proteínas expresada, se produjo un conjugado Src-ATP que demostró ser un ligando de alta afinidad para la tirosina quinasa Csk. Los imitaciones no hidrolizables de fosfoser / fosfotir pueden ser útiles para examinar la funcionalidad de los eventos de fosforilación. Usando ligadura de proteínas expresada, hemos empleado fosfonometileno fenilalanina y fosfonometileno alanina para sondear la fosforilación de Tyr y Ser, respectivamente. Estas herramientas han permitido un análisis de las fosfatasas SH2 (SHP1 y SHP2), revelando una nueva estimulación intramolecular de la actividad catalítica mediada por los eventos de fosforilación correspondientes. También se han utilizado para caracterizar la regulación celular de la enzima del ritmo de la melatonina por fosforilación.