Ensayo de western blotting con actividad cinasa

La acumulación de evidencia sugiere que las interrupciones en la señalización de fosforilación/desfosforilación están asociadas con comportamientos patológicos de las células. Los proyectos de fosfoproteoma han identificado cerca de 300.000 residuos Ser/Thr/Tyr fosforilados en proteínas celulares . Paralelamente, el proyecto genoma humano descubrió aproximadamente 500 proteínas quinasas. Sin embargo, se ha asignado un número limitado de proteínas quinasas a cada sitio de fosforilación.

El ensayo de fosforilación en gel ha sido un método conveniente para detectar actividades de proteína quinasa en muestras solubilizadas con SDS. Este método se aplicó para la identificación de CaMKII, MYPT1-K (o ZIPK) y otros . En este protocolo de ensayo, las proteínas quinasas se cargan en un gel de poliacrilamida SDS incrustado con un polipéptido de sustrato, y luego se someten a renaturalización, fosforilación utilizando ATP radiactivo, seguido de autorradiografía para detectar sustrato fosforilado. Además, se ha detectado autofosforilación de quinasas en la membrana de nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando ATP radiactivo . El material radiactivo puede ser una limitación para los usuarios, debido a las normas de seguridad. Además, los autorradiogramas de proteínas fosforiladas carecen de información sobre los sitios de fosforilación.

Aquí, optimizamos un ensayo alternativo no radiactivo al ensayo tradicional de fosforilación en gel. Llamado western blotting con etiqueta de actividad cinasa (KAT-WB), detecta con éxito Tir-quinasas que se autofosforilan a sí mismas, así como Ser/Thr-quinasas que fosforilan una proteína de sustrato de interés en un sitio específico utilizando anticuerpos específicos de fosfo (P).

La figura 1 muestra los datos de KAT-WB para el ensayo de autofosforilación de Tir-quinasa. Para hacer manchas duplicadas, se cargaron dos alícuotas de un extracto en un gel de poliacrilamida SDS, se sometieron a electroforesis, y luego se transfirieron proteínas a una lámina de membrana de PVDF (0,2 µm). La membrana se trató secuencialmente con 2-propanol tamponado, 6,0 M de clorhidrato de guanidina (Gu-HCl), 3,0 M de Gu-HCl, 0,1 M de Gu-HCl y tampón de renaturalización (ver Protocolo Suplementario). Después de un paso de renaturalización durante la noche a 4 ° C, la membrana se cortó longitudinalmente para generar dos piezas duplicadas (Figura 1). Se incubó una pieza de membrana durante 60 min con MgATP de 1 mm. La otra pieza de membrana se incubó sin MgATP, como control. Ambas láminas se sometieron simultáneamente a inmunodetección con anticuerpo anti-P-Tyr (Clon PY20 a dilución de 1:5000). Como se muestra en la Figura 1, se detectaron múltiples bandas de P-Tyr a 100, 70, 45 y 35 kDa en la membrana de control (parte superior izquierda). Estas proteínas P-Tyr probablemente ya estaban fosforiladas antes de la extracción. La incubación con MgATP después de la separación elevó la fosforilación de Tyr de una proteína a 45 kDa en lisados de músculo cardíaco (Figura 1, arriba a la derecha, carril 2), indicando autofosforilación de residuos de Tyr en esta quinasa en la membrana después de la renaturalización. La Figura 1 muestra densitogramas del carril 2 (- /+MgATP). Para verificar la carga equivalente de proteína en las dos manchas, los filtros se sometieron a tinción de Coomassie (Figura 1, abajo). Una nota técnica es que, durante el desarrollo del método, encontramos que los tratamientos con 2-propanol tamponado y 6M Gu-HCl eran necesarios para la detección de las actividades de la quinasa. Por lo tanto, KAT-WB detectó una cinasa Tyr de 45 kDa.

Otra versión de KAT-WB utiliza fosforilación específica de un sitio de una proteína de sustrato absorbida en la membrana de PVDF en proximidad de la quinasa. Utilizamos el inhibidor de holoenzimas de fosfatasa-1 (PHI-1) como proteína de interés, cuya fosforilación en Thr57 convierte esta proteína celular en un inhibidor de la fosfatasa Ser/Thr tipo 1 . La Figura 2A muestra los datos de KAT-WB utilizando como control positivo ZIPK recombinante, una quinasa Ser / Thr conocida por fosforilar la PHI-1 recombinante en Thr57 . Después de la desnaturalización y el proceso de renaturalización escalonada, la membrana se empapó durante la noche a 4°C en el tampón de renaturalización suplementado con PHI-1 recombinante de tipo salvaje (WT) o una versión no fosforilable (T57H) a 0,2 mg/ml, y luego se ejecutó la reacción de fosforilación con MgATP. PHI-1 fosforilado en la membrana se detectó utilizando anticuerpos anti-P-PHI-1 (Thr57), y esto reveló una banda del ZIPK recombinante. Sin embargo, solo se detectó una señal débil en las membranas de control sin PHI-1 o con la versión T57H de PHI-1. Estos datos sugieren que las cinasas renaturadas en la membrana son capaces de fosforilar sustratos que también se absorben en la membrana. Se aplicó KAT-WB para detectar múltiples quinasas PHI-1 en tejidos y células (Figura 2B). Los extractos de esqueletos de ratas, músculos cardíacos y células Neuro2a se sometieron al ensayo KAT-WB. En comparación con el control sin ATP (izquierda, arriba), las señales de P-PHI-1 aparecieron en el blot incubado con MgATP de 1 mM (derecha, arriba). Se detectaron bandas prominentes de P-PHI-1 en lisados de células Neuro2a a 100, 60 y 49 kDa (carril 3, punta de flecha abierta). Sin embargo, no se evidenciaron bandas para P-PHI-1 en el carril con los extractos de músculos esqueléticos y cardíacos (carriles 1 y 2). La señal de P-PHI-1 no fue mejorada por el paso de fosforilación sin PHI-1 (Figura 2, abajo, en blanco: BLK). Estos resultados muestran que hay múltiples quinasas PHI-1 expresadas en las células neuronales, pero no en los músculos esqueléticos o cardíacos. Esto nos proporciona una herramienta poderosa para detectar quinasas múltiples específicas de sustrato en células y tejidos. Una nota técnica es que la renaturalización nocturna con PHI-1 era necesaria para la detección de las señales de fosforilación, y que una mayor concentración de PHI-1 no aumentaba la intensidad de la tinción (no se muestra).

Con base en estos datos, proponemos que el KAT-WB es capaz de detectar la autofosforilación de cinasas Tir y la fosforilación de sitios específicos de proteínas de sustrato selectivo de interés por proteínas quinasas múltiples presentes en tejidos y células. KAT-WB comparte esencialmente las ventajas del ensayo tradicional de fosforilación en gel, que detecta las actividades de la quinasa en una mezcla cruda, como los extractos celulares, exponiendo sus tamaños moleculares . Otra ventaja de estos dos ensayos es que las modificaciones post-traslacionales (PTMs) de las quinasas en las células se pueden conservar en un punto de tiempo deseado bajo condiciones específicas, porque las muestras para estos ensayos se desnaturalizan rápidamente con el tampón, incluido el SDS, eliminando la fosforilación y desfosforilación en los extractos . La mayoría de las proteínas quinasas se regulan a través de la PTM. KAT-WB es capaz de monitorear las fluctuaciones en las actividades de la quinasa, incluso si los PMT reguladores aún no se han caracterizado. KAT-WB es incapaz de detectar cada quinasa en los extractos celulares porque solo las enzimas monoméricas que renaturalizan de manera efectiva bajo las condiciones empleadas muestran actividad. Sin embargo, las modificaciones de KAT-WB deben ser capaces de detectar quinasas reguladas por calmodulina y ciclinas, como se ha hecho mediante el ensayo de fosforilación en gel . La mejora de la eficiencia de renaturalización y una combinación con inmunoprecipitación/inmunodepresión con anticuerpos para quinasas pueden ampliar la utilidad del enfoque.

Es de destacar que, además de la fosforilación, el principio del protocolo KAT-WB se puede aplicar para la detección de otras enzimas PTM, como acetilasas, metilasas y ubiquitinas ligasas, cuando se dispone de anticuerpos específicos para PTM. Junto con el desarrollo de anticuerpos que reconocen los PTMS específicos del sitio, se ampliarán los objetivos de investigación cubiertos por el western blot con etiquetas de actividad.