La colocalización de alta resolución de una sola molécula de Cy3 y Cy5 unida a macromoléculas mide distancias intramoleculares a través del tiempo

Materiales y métodos

Preparación de ADN dúplex. Para hacer las moléculas de ADN dúplex de 30 bp, se hibridaron dos oligonucleótidos con la siguiente secuencia y modificaciones (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). El oligonucleótido 5 ‘- GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC – 3′ fue etiquetado con Cy5 en su extremo de 5′ y con Cy3 en su extremo de 3’. El oligonucleótido complementario fue marcado con biotina en ambos extremos.

Expresión y Purificación de proteínas. El gen de la proteína fluorescente amarilla (YFP) en el plásmido p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (un regalo de H. Lee Sweeney, Universidad de Pensilvania, Filadelfia) fue eliminado por PCR. El plásmido P2bac / pFastBac-M5-CaM resultante codifica para la miosina V de pollo que se trunca en Glu-1099. Una cremallera de leucina siguió a la bobina enrollada nativa para garantizar la dimerización. Para facilitar la purificación, la proteína miosina V fue etiquetada N-terminalmente con una etiqueta DE BANDERA (DYKDDDDK). Se generaron dos baculovirus recombinantes para la expresión de proteínas en células Sf9. Uno codificó la miosina V truncada y la calmodulina Drosophila melanogaster derivada del plásmido p2Bac / pFastBac-M5-CaM. El segundo virus codificó la cadena ligera esencial humana derivada del plásmido P2BAC / pFastBac-ELC. Ambos virus se utilizaron para la coinfección de células Sf9. La proteína fue expresada y purificada según lo descrito por Sweeney et al. (20).

Etiquetado e Intercambio de Calmodulina. La calmodulina se expresó y se etiquetó con Cy3 o Cy5 de la siguiente manera: Se introdujo una sola cisteína en el erizo de mar calmodulina por medio de la mutación Q143C. Esta calmodulina se expresó en Escherichia coli y se purificó como se describe en el ref. 21. La calmodulina se etiquetó con soluciones madre de Cy3-maleimida o Cy5-maleimida (Amersham Biosciences) (en DMSO) a una proporción molar de 1,4 veces durante 20 min. El exceso de tinte se eliminó por filtración de gel en tampón de intercambio (abajo), seguido de absorción hidrofóbica durante la noche en biobastos (Bio-Rad). La incorporación en la etiqueta fue del 102% para Cy3-calmodulina y del 75% para Cy5-calmodulina. Las alícuotas se almacenaron a -80 ° C.

El intercambio de calmodulina etiquetada sobre miosina V se realizó como se describe, pero con algunas modificaciones (22). La miosina V (150 nM) se incubó con calmodulina marcada con Ci3 de 0,7 nM y calmodulina marcada con Ci5 de 0,8 nM en tampón de intercambio (25 mm KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) a 22°C durante 2 min. Para intercambiar calmodulinas, se añadió CaCl2 de 0,9 mm y se incubó la mezcla a 22°C durante 5 min. La reacción se apagó con EGTA de 7 mm. La mezcla de reacción se aplicó en un dispositivo de ultrafiltración Nanocep (Pall) de 100K MWCO y se lavó tres veces con volúmenes iguales de AB (abajo) para purificar la miosina V del exceso de calmodulina.

Preparación de Celdas de flujo. La célula de flujo se construyó con un portaobjetos de vidrio para microscopio y cubreobjetos altamente refractantes hechos de NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) unidos por piezas de cinta adhesiva de doble cara.

Para los experimentos de miosina V, se incubaron 15 µl de biotina-ASC (1 mg·ml-1) en la celda de flujo durante 2 min, después de lo cual se pasaron 30 µl de tampón AB (25 mM KCl/25 mM imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM TDT/1 mg·ml-1 ASC) a través de la celda de flujo para eliminarlo. Se añadieron quince microlitros de neutravidina (Sondas moleculares) de 0,5 mg/ml a la célula y se dejó incubar durante 2 min, después de lo cual se realizó otro lavado con tampón AB. La célula de flujo se incubó con 15 µl de filamentos de actina de faloidina biotinilados (250 nM) durante 5 min, seguido de un lavado de 100 µl con tampón AB. Finalmente, la célula se cargó con 20 µl de tampón de imagen que incluía miosina V intercambiada con calmodulina, 5 µM de calmodulina, 300 nM de ATP, un sistema de regeneración de ATP (0,1 mg·ml-1 de creatina fosfocinasa/1 mM de creatina fosfato) y Tritón-X 100 al 0,5% (vol/vol) para reducir la unión inespecífica. La celda fue sellada con grasa al vacío y se tomaron imágenes de inmediato. La concentración motora final resultó en actina escasamente decorada y, por lo tanto, permitió un análisis de moléculas de miosina V individuales.

Para los experimentos de ADN, la biotina-BSA y la neutravidina se cargaron de la misma manera que para los experimentos de miosina V, pero los lavados se hicieron con tampón T50 (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Una vez que la célula de flujo tenía un revestimiento de neutravidina, 15 µlof de dsDNA (30 nM) en el tampón T50 con 1 mg·ml-1 de ASC se fluyeron e incubaron durante 2 minutos, después de lo cual se fluyeron 100 µl de tampón para imágenes. A continuación, la celda de flujo se selló con grasa al vacío y se tomó una imagen de inmediato. La decoración resultante de moléculas de ADN en la superficie era lo suficientemente escasa que las manchas fluorescentes de diferentes moléculas rara vez se superponían.

Configuración del microscopio. El microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)se configuró como se describe en la ref. 8, con algunas modificaciones (Fig. 5, que se publica como información de apoyo en el sitio web de la PNAS). Los haces de fuente de excitación a 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) y 633 nm (JDS Unifase, San José, CA) se combinaron mediante un espejo dicroico y se expandieron a un diámetro de 7 mm. Estas fuentes se enfocaron (longitud focal = 500 mm) en el plano focal posterior de un objetivo Olympus 1.65 NA ×100 TIRF por medio de una línea láser dicroica en una etapa de traducción lineal que permite el funcionamiento del microscopio en modos de epifluorescencia o TIRF. El objetivo se colocó bajo una etapa de nanotranslación piezoeléctrica de dos ejes de circuito cerrado equipada con sensores capacitivos para la medición de posición (Physik Instrumente, Auburn, MA). La luz reflejada que salía de la abertura trasera del objetivo se dirigía a un fotodiodo cuadrante para proporcionar una señal para un bucle de retroalimentación de enfoque que fijaba la distancia entre el objetivo y la muestra con un actuador electrostrictivo (Newport, Fountain Valley, CA). La emisión de fluorescencia fue recogida por el objetivo, pasada a través de dos filtros de muesca de película delgada de línea de parada (Semrock, Rochester, NY), uno para cada fuente de excitación, y transmitida a través de un aparato de doble visión que permitía obtener imágenes simultáneas de los canales Cy3 y Cy5 en una sola cámara EMCCD iXon DV 887 (Tecnología Andor, Belfast, Irlanda). Se tomaron imágenes de todos los datos con un tiempo de integración de 0,5 segundos. La diafonía entre los dos canales (10%) presumiblemente sesga las mediciones de distancia hacia valores más pequeños. Nuestro error experimental, sin embargo, lo hace indetectable, como se muestra en las simulaciones de Monte Carlo en las que se crearon 100 pares de imágenes modeladas de fluoróforos individuales separados por 10 nm y analizados de manera idéntica a los datos de ADN (descritos a continuación). Se calcularon imágenes simuladas de funciones de dispersión de puntos fluorescentes generando una distribución de intensidad gaussiana 2D integrada con un fondo constante al que se añadió ruido de disparo. Los picos simulados tenían las mismas dimensiones y relación señal / ruido que los picos reales. Los datos simulados con diafonía del 10% y los datos simulados sin diafonía son indistinguibles mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).

Análisis de datos. Se realizó un mapeo de registro de los canales Cy3 y Cy5 con fiduciales consistentes en perlas de transfluosfera de 100 nm (Sondas Moleculares). Estaban excitados a 532 nm, y emiten con un amplio espectro de emisión. La cuenta era detectable en ambos canales. Localizamos un único cordón asociado al cubreobjetos, y con nuestra etapa piezoeléctrica lo escalonamos con precisión nanométrica en un patrón de cuadrícula (con un espaciado de 0,5 µm), tomando una imagen en cada parada. El resultado final fue una pila de 312 imágenes que muestra el cordón en ambos canales en diferentes posiciones (Fig. 1a).