Les protéines kinases sont la plus grande superfamille d’enzymes impliquée dans la transduction du signal cellulaire et représentent des cibles thérapeutiques pour une gamme de maladies. De nombreux laboratoires ont déployé des efforts intensifs pour comprendre leurs mécanismes catalytiques, découvrir des inhibiteurs et discerner leurs fonctions cellulaires. Dans cette revue, nous décrirons deux approches développées pour analyser les protéines kinases: inhibition analogique bisubstrate et utilisation analogique phosphonate. Ces deux méthodes ont été utilisées en combinaison avec la méthode de semi-synthèse des protéines pour faire progresser notre compréhension des interactions kinase-substrat et de l’élucidation fonctionnelle de la phosphorylation. Des travaux antérieurs sur la nature du mécanisme de la protéine kinase suggèrent qu’il suit un état de transition dissociatif. Un analogue de bisubstrate a été conçu contre la kinase du récepteur de l’insuline pour imiter la géométrie d’une distance de coordonnées de réaction de l’état de transition dissociative. Ce composé bisubstrate s’est avéré être un inhibiteur puissant contre la kinase du récepteur de l’insuline et occupait les sites de liaison peptidique et nucléotidique. Les composés bisubstrés avec un potentiel de liaison à l’hydrogène altéré ainsi que des espaceurs variables entre l’adénine et le peptide démontrent l’importance des caractéristiques de conception originales. Nous avons également montré que des analogues bisubstrés apparentés peuvent être utilisés pour bloquer efficacement les sérine / thréonine kinases, y compris la protéine kinase A. Étant donné que de nombreuses protéines kinases reconnaissent des substrats protéiques repliés pour une phosphorylation efficace, il était avantageux d’incorporer les conjugués peptide-ATP dans les structures protéiques. En utilisant une ligature protéique exprimée, un conjugué Src-ATP a été produit et s’est avéré être un ligand à haute affinité pour la tyrosine kinase Csk. Des imitations non hydrolysables de phosphoSer / phosphoTyr peuvent être utiles pour examiner la fonctionnalité des événements de phosphorylation. En utilisant la ligature protéique exprimée, nous avons utilisé la phosphonométhylène phénylalanine et la phosphonométhylène alanine pour sonder la phosphorylation de Tyr et de Ser, respectivement. Ces outils ont permis une analyse des SH2-phosphatases (SHP1 et SHP2), révélant une nouvelle stimulation intramoléculaire de l’activité catalytique médiée par les événements de phosphorylation correspondants. Ils ont également été utilisés pour caractériser la régulation cellulaire de l’enzyme du rythme de la mélatonine par phosphorylation.