anyagok és módszerek
Duplex DNS-előkészítés. A 30 bp-es duplex DNS-molekulák előállításához két oligonukleotidot hibridizáltunk a következő szekvenciával és módosításokkal (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Az 5 ‘- gggtatggagattttttagcggagtgacagc-3 ‘oligonukleotidot az 5′ végén Cy5-tel, a 3’ végén pedig Cy3-Mal jelöltük. A komplementer oligonukleotidot mindkét végén biotinnal jelöltük.
fehérje expresszió és tisztítás. A sárga fluoreszcens fehérje (YFP) gént a p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM plazmidban (H. Lee Sweeney ajándéka, Pennsylvaniai Egyetem, Philadelphia) PCR-rel törölték. A kapott p2Bac / pFastBac-M5-CaM plazmid a csirke miozin v kódját kódolja, amely a Glu-1099-nél csonkolt. Leucin cipzár követte a natív tekercselt tekercset a dimerizáció biztosítása érdekében. A tisztítás megkönnyítése érdekében a miozin v fehérjét N-terminálisan megjelölték a zászló-tag (DYKDDDDK). Két rekombináns baculovírust állítottak elő a fehérje expressziójához az Sf9 sejtekben. Az egyik a csonka miozin V-t és a p2Bac/pFastBac-M5-CaM plazmidból származó Drosophila melanogaster kalmodulint kódolta. A második vírus kódolta a p2bac/pFastBac-ELC plazmidból származó emberi esszenciális könnyű láncot. Mindkét vírust az SF9 sejtek koinfekciójára használták. A fehérjét a Sweeney et al. által leírt módon expresszáltuk és tisztítottuk. (20).
Calmodulin címkézés és csere. A kalmodulint a következőképpen fejeztük ki és jelöltük Cy3-mal vagy Cy5-Tel: egyetlen ciszteint vezettünk be a tengeri sün kalmodulinba a Q143C mutáció révén. Ezt a kalmodulint Escherichia coli-ban expresszálták és a ref. 21. A kalmodulint Ci3-maleimiddel vagy Ci5-maleimiddel (Amersham Biosciences) jelöltük törzsoldatok (DMSO-ban) 1,4-szeres mólarányban 20 percig. A felesleges festéket gélszűréssel távolítottuk el csere pufferbe (lent), majd egy éjszakán át hidrofób abszorpció a BioBeads-ra (Bio-Rad). A címke hozzákeverése 102% volt a Cy3-kalmodulin és 75% a Cy5-kalmodulin esetében. Az alikvotokat -80cc-n tárolták.
a jelzett kalmodulin cseréjét a miozin V-re a leírtak szerint, de néhány módosítással végeztük (22). A miozin V-T (150 nM) 0,7 nM-es Cy3-jelölt kalmodulinnal és 0,8 nM-es Cy5-jelölt kalmodulinnal inkubáltuk cserepufferben (25 mM KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) 22 Ca-n 2 percig. A kalmodulinok cseréjéhez 0,9 mM-es CaCl2-t adtunk hozzá, majd az elegyet 22 6CC hőmérsékleten 5 percig inkubáltuk. A reakciót 7 mM-es EGTA-val leállítottuk. A reakcióelegyet egy 100k Mwco Nanocep ultraszűrő készülékre (Pall) visszük fel, és háromszor mossuk le azonos térfogatú AB-vel (lent), hogy megtisztítsuk a miozin V-t a felesleges kalmodulintól.
Áramlási Cella Előkészítése. Az áramlási cellát üveg mikroszkóp csúszdával és nlaf21-ből (va Optical Labs, San Anselmo, CA) készült, erősen refraktáló fedőlapokkal építették, amelyeket kétoldalas Scotch szalag darabjai tartottak össze.
a miozin V kísérletekhez 15 db biotin-BSA-t (1 mg·ml-1) inkubáltunk az áramlási cellában 2 percig, majd 30 db AB puffert (25 mM KCl/25 mM imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg·ml-1 BSA) vezettünk át az áramlási cellán, hogy kimossuk. Tizenöt mikroliter 0,5 mg/ml Neutravidint (molekuláris próbákat) adtunk a sejthez, majd 2 percig inkubáltuk, majd újabb mosást végeztünk AB pufferrel. Az áramlási cellát 15 6L biotinilezett falloidin aktin filamentummal (250 nM) inkubáltuk 5 percig, majd AB pufferrel 100 ml-es mosást végeztünk. Végül a sejtet 20 6 liter képalkotó pufferrel terheltük meg, beleértve a kalmodulin-cserélt miozin V-T, 5 mm-es kalmodulint, 300 nM-es ATP-t, egy ATP regeneráló rendszert (0,1 mg·ml-1 kreatin-foszfokináz/1 mM kreatin-foszfát) és 0,5% (vol/vol) Triton-X 100-at a nem specifikus kötődés csökkentése érdekében. A cellát vákuumzsírral lezárták, és azonnal leképezték. A végső motorkoncentráció ritkán díszített aktint eredményezett, így lehetővé tette az egyes miozin v molekulák elemzését.
a DNS-kísérleteknél a biotin-BSA-t és a Neutravidint ugyanúgy töltötték be, mint a miozin V kísérleteknél, de a mosást T50 pufferrel végezték (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Miután az áramlási cella Neutravidinbevonatot kapott, 15 db dsDNS (30 nM) került be a T50 pufferbe 1 mg·ml-1 BSA-val, majd 2 percig inkubáltuk, majd 100 ml képalkotó puffer került be. Az áramlási cellát ezután vákuumzsírral lezárták, és azonnal leképezték. A DNS-molekulák ebből eredő díszítése a felszínen elég ritka volt, hogy a különböző molekulák fluoreszcens foltjai ritkán átfedjenek.
Mikroszkóp Beállítása. A teljes belső reflexiós fluoreszcencia (TIRF) mikroszkópot a ref. 8, néhány módosítással (ábra. 5, amelyet támogató információként tesznek közzé a PNAS webhelyén). Az 532 nm-es (koherens, Santa Clara, CA) és a 633 nm-es (JDS Uniphase, San Jose, CA) gerjesztő sugárnyalábokat egy dikroikus tükör kombinálta, és 7 mm átmérőre bővítette. Ezeket a forrásokat (fókusztávolság = 500 mm) az Olympus 1.65 NA 600 TIRF objektív hátsó fókusztengelyére fókuszálták egy lézervonal dikroikus segítségével egy lineáris transzlációs szakaszban, amely lehetővé teszi a mikroszkóp működését epifluoreszcencia vagy TIRF módban. A cél egy zárt hurkú, kéttengelyes, piezo nanotranszlációs szakasz alatt volt elhelyezve, kapacitív érzékelőkkel felszerelve a helyzetméréshez (Physik Instrumente, Auburn, MA). Az objektív hátsó nyílásából kilépő visszavert fényt egy kvadráns fotodiódára irányították, hogy jelet adjanak egy fókusz visszacsatolási huroknak, amely az objektív és a minta közötti távolságot egy elektrosztatikus működtetővel (Newport, Fountain Valley, CA) rögzítette. A fluoreszcencia-emissziót az objektív gyűjtötte, két StopLine vékonyréteg-szűrőn (Semrock, Rochester, NY) keresztül vezetett, mindegyik gerjesztési forráshoz egyet, és egy kettős nézetű berendezésen keresztül továbbította, amely lehetővé tette a Cy3 és Cy5 csatornák egyidejű képalkotását egyetlen ixon DV 887 EMCCD kamerán (Andor Technology, Belfast, Írország). Az összes adatot 0,5 másodperces integrációs idővel képeztük. A két csatorna közötti áthallás (10%) feltehetően torzítja a távolságméréseket a kisebb értékek felé. Kísérleti hibánk azonban kimutathatatlanná teszi, amint azt a Monte Carlo szimulációk is mutatják, amelyekben 100 pár modellezett képet készítettek 10 nm-rel elválasztott egyetlen fluorofórról, és ugyanúgy elemezték, mint a DNS-adatokkal (lásd alább). A fluoreszcens pontterjedési függvények szimulált képeit egy integrált 2D Gauss-intenzitás-Eloszlás generálásával számítottuk ki, állandó háttérrel, amelyhez lövés zajt adtak. A szimulált csúcsok mérete és jel-zaj aránya megegyezett a valós csúcsokéval. A 10% – os áthallással végzett szimulált adatok és az áthallás nélküli szimulált adatok nem különböztethetők meg Kolmogorov-Szmirnov teszttel (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Adatelemzés. A Cy3 és Cy5 csatornák regisztrálási feltérképezését 100 nm-es Transzfluoszféra-gyöngyökből (molekuláris Szondákból) álló fiduciálokkal végeztük. 532 nm-en izgatottak voltak, és széles emissziós spektrummal bocsátottak ki. A gyöngy mindkét csatornánkon kimutatható volt. A fedőréteghez egyetlen gyöngyöt találtunk, és piezo-fokozatunkkal nanométeres pontossággal léptünk rá rácsmintában (0,5-Ft távolsággal), minden megállónál képet készítve. A végeredmény egy 312 képből álló köteg volt, amely mindkét csatornán különböző pozíciókban mutatja a gyöngyöt (ábra. 1a).
a DNS-adatokat házi készítésű szoftverekkel elemeztük a matlab (Mathworks, Natick, MA) segítségével. A rutin automatikusan megkeresi a csúcsokat a képen a nagy intenzitású pixelek meghatározásával, és biztosítja, hogy a környező pixelek intenzitása az egyetlen fluorofor esetében elvárható legyen. Mielőtt a csúcsokat egy 2D Gauss-függvényhez illesztenénk, hogy megkapjuk a középső helyeit, csúcspárokat keresünk. A CY5 csatornában található pixelek a Cy3 csatornára vannak leképezve, és a környező Cy3 pixelek csúcsainak keresése történik. Ha egy csúcsot találunk, akkor a Cy5 csúcsot és a Cy3 csúcsot párosnak tekintjük a további elemzéshez. Minden csúcs illeszkedik egy 2D Gauss-függvényhez a megfelelő térben, a fenti gyöngyöknél leírtak szerint (EKV. 1 ). Az illesztési középpont hibáját az összegyűjtött fotonok számával (Ny) számítják ki, 
a Cy5 helyét a Cy3 csatornához rendelik, és kiszámítják a köztük lévő távolságot. A DNS-adatok számítási elemzése után az azonosított fluorofor párokat manuálisan szűrtük annak biztosítására, hogy a párok ne legyenek közel más fluoroforokhoz, amelyek beavatkoztak volna a párok elemzésébe.
a miozin v adatait úgy elemeztük, hogy először egy mozgó motort azonosítottunk szemmel. Házi szoftver írt matlab majd illeszkedik a kezdő pár fluoreszcens csúcsok 2D Gauss függvények a fent leírt, és továbbra is nyomon követni a csúcsok, amíg a felhasználó által megadott. Azokat a motorokat elemeztük, amelyek konjugált színezékei egyetlen lépésben fehérítettek, mint a legtöbb megfigyelt motor esetében, ami biztosította, hogy valóban csak egy Cy3 címkével és egy Cy5 címkével rendelkező motorokat tanulmányozzunk. A kapott pályákat úgy regisztráltuk, hogy a Cy5 pályát a Cy3 csatornára térképeztük fel. A legkisebb négyzetek lineáris illesztése mindkét pálya pontjaihoz megadta az aktinszál orientációját, amelyre a pályákat vetítették. A lineáris illesztés (az aktinszál) mentén lévő távolságokat az idő függvényében ábrázoltuk, hogy lássuk a fejek relatív távolságát (ábra. 4).
egy differenciálisan jelölt miozin v molekula időnyoma, amely egy aktinszál mentén halad. A címkék (Cy3 és Cy5) kovalensen kapcsolódnak a miozin v molekulára cserélt kalmodulinokhoz. Ebben a nyomban a fluoreszcens szonda mindkét helye 72 nm-es lépéseket tesz, jelezve, hogy a kalmodulinokat a motor domén közelében cserélték. A szondák váltakozó pozíciói közvetlen megfigyelést biztosítanak a miozin v kéz-kéz járási mechanizmusáról.