a vírusokkal végzett kísérleti munka során elengedhetetlen a vírus titer ellenőrzése. A különböző laboratóriumokban végzett vizsgálatok összehasonlításának megkönnyítése érdekében kívánatos a harmonizált standard módszerek alkalmazása. Humán herpeszvírus esetében 6 (HHV-6) , a A a legtöbb ember ki volt téve , az 50%-os szövettenyészet fertőzőképességi dózisa (TCID50) módszert gyakran használják a vírus titerének értékelésére. Gyakran használt leolvasás a citopátiás hatások (CPE) szemvizsgálata, azaz a fertőzött sejtek megnagyobbodása . Ennek a megközelítésnek az egyik akadálya, hogy a sejtek akkor is megnagyobbodhatnak, ha nem fertőzöttek. Különösen nehéz a fertőzés határvonalán a titrálási sorozatban, mivel a fertőzés miatt megnagyobbodott sejtek általában kevésbé növekednek a vírus fokozott hígításával (további fájl 1: S1 ábra). Az immunfluoreszcencia vizsgálat (IFA) egy alternatív kiolvasási megközelítés a szemvizsgálathoz a TCID50 értékelésben vagy a fertőző egységek, azaz a fertőzött sejtek frakciójának kiszámításához . Az IFA-alapú kiolvasás jobban megkülönbözteti a fertőzötteket a nem fertőzött sejtektől, de a festés fáradságos, és jelentős számú sejtet kell megszámolni a megbízható értékek eléréséhez. Az egyes sejtek monitorozása kockázatot jelent a sejt pozitivitásának félreértelmezésére, ami mind a szemvizsgálat, mind az IFA alapú leolvasások hátránya. Ezért kifejlesztettük és validáltuk a tcid50 alternatív kiolvasási megközelítését, ahol a vírus DNS-terhelésének növekedését a tcid50 tenyésztési lemezek minden titrálási kútjában mérjük valós idejű kvantitatív PCR (Q-PCR) alkalmazásával. Ezt a megközelítést összehasonlították a tcid50 szemészeti vizsgálatával és IFA leolvasásával, valamint a fent leírt fertőző egységek megközelítésével.
HHV-6A-t (GS törzs) szaporítottunk a HSB-2 T-sejtvonalban GlutaMAX-ban, amely Rpmi 1640 táptalajt (Invitrogen, Egyesült Királyság) tartalmazott, kiegészítve 10% magzati szarvasmarha szérummal (HyClone, UT), 100 egység/ml penicillinnel és 100 egység/ml sztreptomicinnel (Invitrogen). Amikor az élő sejtek körülbelül 50% – a megnagyobbodott, a felülúszót betakarították és azonnal lefagyasztották alikvotokban -80 kb C-on az elemzésig. Kontrollként a 17-es áthaladás vírus felülúszóját (P17) UV-fénnyel inaktiváltuk 20 percig, vagy 56 6C-os hőkezeléssel 1 órán át. A HHV-6A replikációt HSB-2 sejtekben tíz napig követték Q-PCR (Applied Biosystems, Egyesült Királyság) alkalmazásával, a korábban leírtak szerint . A Q-PCR analízist megelőzően a SEJTSZUSZPENZIÓKBÓL a DNS-t a gyártó protokolljának megfelelő 96 lyukú lemezgyöngy alapú készlet (MagMAX-96 Viral RNS Isolation Kit, Applied Biosystems) segítségével extraháltuk. A víruscsomagok HHV-6A DNS-tartalmának felmérése érdekében a Q-PCR-t a fent leírtak szerint végeztük a DNS-extrakció után szűrőoszlopokkal (QIAGEN GmbH, Németország).
a tcid50 tenyészlemezek felállításához kútonként 40 6L 104 HSB-2 sejtszuszpenziót vetettünk be kerek fenekű 96 lyukú tenyészlemezekbe. A sejteket 3-4 órán át beoltottuk 160 MHz-es ötszörös HHV-6A felülúszó hígítással, hígításonként hat ismétléssel. A Mock és a medium kontrollokat három példányban foglalták el az összes lemezen. A sejteket egyszer megmossuk, mielőtt minden kútból 50-70 MHz-es sejtszuszpenziót vettünk volna, és -80 C-on tároltuk a fertőzés utáni nulla nap (dpi) mintaként. A fennmaradó sejtszuszpenziókat hét napig inkubáltuk 37 C. Hét dpi-nél a felolvasztott nulla dpi-lemezt és a hét dpi-lemezt DNS-extrakciónak vetettük alá a fent leírt gyöngyalapú készlet alkalmazásával. Ezt követően a vírus DNS-ét Q-PCR-rel számszerűsítettük a fent leírtak szerint.
az IFA esetében a sejteket üveglemezre rögzítettük aceton és metanol 1:1 arányú keverékével -20 6c hőmérsékleten 10 percen keresztül, 5% kecske szérummal és 3% BSA-val blokkoltuk PBS-ben, és a HHV-6 glikoprotein gp116/54/64-re specifikus elsődleges egér monoklonális antitesttel festettük (Advanced Biotechnologies, MD). A festést egy Alexa 633 konjugált kecske anti-egér IgG (Invitrogen) vizualizálta. A sejtmagok megjelenítésére 4′,6-diamidino-2-fenilindollal (Vector laboratories, CA) festést használtunk. A fedőlemezeket rögzítő közeggel szereltük fel (DAKO A / S, Dánia), a tárgylemezeket konfokális mikroszkóppal elemeztük (Leica Microsystems, Németország). A fertőzött sejtek frakcióját kézi számlálással határoztuk meg. Ha a sejtek 1/3-a tartalmazott vírusfehérjét, akkor a kútonként 25 sejtet számoltunk, és ha a sejtek <1/3-a tartalmazott vírusfehérjét, akkor a kútonként 100 sejtet számoltunk. Kutak, ahol a pozitívra festett sejtek 2% – át fertőzöttnek tekintették. Az egyes kutak vírus DNS-terhelésének növekedése korrelált az IFA-festéssel, amely képletet készít a szoftverben Excel (Microsoft, WA). Ez a képlet azt kérdezi, hogy a tcid50 lemez egy bizonyos kútjában a vírus DNS eltolódott-e bizonyos számú alkalommal, ami be van állítva, és ha ugyanaz a kút pozitív volt az IFA-ban, vagy sem.
a Q-PCR leolvasással való összehasonlításhoz az összes TCID50 lemezt két független ellenőr (ocular TCID50) fáziskontraszt mikroszkóppal végzett szemvizsgálattal értékelték. A kutakat fertőzöttnek tekintették, ha legalább egy megnagyobbodott sejtet találtak. Mindkét kiolvasási megközelítés esetében a TCID50-et a Reed és a Muench képlet alapján számítottuk ki .
a Q-PCR (Q-PCR TCID50) által meghatározott tcid50 eredményeket összehasonlítottuk az IFA (personal communication with Louis Flamand) által végzett fertőző egységek értékelésével három időpontban a P19 és egy a P27 esetében. Röviden, 2,5 * 105 HSB-2 sejtet oltottunk be a fent leírtak szerint különböző vírushígításokkal, minden hígításhoz három példányban. Két dpi-nél a sejteket IFA-nak vetettük alá, amely a korai P41 vírusfehérjét célozta meg (9a5d12 klón, Santa Cruz Biotech. Inc., CA) a fent leírtak szerint. A fertőző egység / ml-ben kifejezett vírustitert úgy számítottuk ki, hogy a fertőzött sejtek frakcióját megszorozzuk a nulla DPI-vel és hígítási tényezőkkel rendelkező sejtek teljes számával.
a vírus DNS-terhelés növelésének optimális időpontjának meghatározásához a vírus replikációját tíz napig követtük. Hét napra volt szükség a vírus DNS-ének megfelelő növekedéséhez (1.ábra), ezért a betakarítási időpontot választották. A pozitív fertőzésnek megfelelő relatív vírus DNS-növekedés vágási pontjának beállításához a vírus DNS-terhelésének növekedése korrelált a vírusfehérje expressziójával. Az IFA-t hét dpi-n végeztük minden kút sejtjein, három tcid50 lemezen, két különböző vírustételhez. Az optimális vágási pont a vírus DNS tízszeres növekedése volt, ahol a fehérje expresszióval való korreláció a kutak 93% – ában volt megfigyelhető (2.ábra).
a HHV-6A (GS törzs) replikációja, amelyet Q-PCR követ. A bemutatott adatok a triplicate tenyészetek átlageredményei (sem) a fertőzés minden sokaságára (MOI). Az összekötő vonalak megszakadnak, amikor a vírus DNS-terhelése a kimutatási határ alá esett.
a fertőzés vágási pontjának meghatározása. A fertőzés optimális vágási pontja tízszeres növekedés volt, ahol a fehérje expresszióval való korrelációt a kutak 93% – ában észlelték az IFA által a késői vírusfehérjét célzó antitesttel gp116/54/64. Nincs jól tartalmazott vírusfehérje, ahol a vírus DNS-terhelése nem nőtt tízszer. A bemutatott adatok három tcid50 lemez Átlagos eredményei (sem).
összehasonlítva a Q-PCR TCID50 és az okuláris és IFA TCID50 értékeit, egy Q-PCR TCID50 1,41 okuláris és 1,03 IFA TCID50 értéknek felelt meg 13, illetve 5 értékelés alapján. A Q-PCR TCID50 nem adott statisztikailag eltérő értékeket az okuláris vagy IFA TCID50-hez képest (p = 0,41 vagy p = 0,29) (páros T-teszt) (1.táblázat).
a vírus DNS-kópiaszámokat gyakran használják az adott víruscsomagban található vírusrészecskék mennyiségének durva becslésére. Nem biztos azonban, hogy ez mennyire felel meg a fertőzőképességnek. Ennek felmérésére a tcid50 értékeket összehasonlítottuk az adott tétel vírus DNS-kópiaszámaival. A vírus DNS-terhelés és a Q-PCR TCID50 értékek átlagos aránya a vírustételekben hasonló volt a P17 és a P19 esetében; 6,3*105 és 2,0*106 vírus DNS kópia / TCID50. A P21 esetében azonban az arány lényegesen magasabb volt, 1,3 * 108 vírus DNS kópia / TCID50 (1.táblázat). Így a vírus DNS mérése a tétel felülúszóiban nem elegendő a tétel fertőzőképességének helyes meghatározásához, ezért biológiai vizsgálatokat kell végezni a vírustiterek pontos meghatározásához.
az átlagos intra-assay variációs koefficiens (CV) A Q-PCR TCID50 esetében 9% volt, amit három tcid50 tenyészetlemez párhuzamos duplikált extrakciójával és Q-PCR-jével határoztak meg. A szemészeti TCID50 esetében az intra-assay CV 45% volt, amelyet összesen tizenkét tcid50 tenyésztési lemez határozott meg, amelyeket két független Értékelő olvasott fel. Az intra-assay CV 14% volt az IFA TCID50 esetében, amelyet két párhuzamos sejtfestéssel határoztak meg két futásból. A fertőző egységek megközelítésénél az intra-assay CV 43% volt, amelyet négy párhuzamos sejtfestéssel határoztak meg egy futásból. Az átlagos inter-assay CV 73% volt a Q-PCR TCID50 és 66% az ocularis TCID50 esetében, három vírustétel öt, három és három alkalommal történő futtatására meghatározva. Az IFA TCID50 esetében az Inter-assay CV 25% volt, egy tételes futtatásra háromszor meghatározva. A fertőző egységek megközelítésénél az Inter-assay CV 77% volt, amelyet három külön sorozat határoz meg egy tételre.
Összefoglalva, az itt leírt Q-PCR TCID50 módszer jól korrelál a vírusfehérjék expressziójával, így nagy specifitással rendelkezik a fertőző dózis tekintetében. Az intra-assay CV értékek alapján robusztusabb, mint az ocularis TCID50, az IFA TCID50 és a fertőző egységek megközelítése. Az intra-assay CV ebben a beállításban azt méri, hogy egy adott kiolvasási megközelítés mennyire pontos, ezért a legpontosabb érték a különböző módszerek összehasonlításához. A módszer adaptálásához meg kell határozni a vágási pontot minden vizsgált vírustörzs és minden használt sejtvonal esetében. A Q-PCR kiolvasási megközelítés munkaigényesebb, mint a szemvizsgálat, de véleményünk szerint lényegesen kevésbé fáradságos, mint az IFA TCID50 és a fertőző egységek megközelítése. A laboratóriumi erőforrások szempontjából drágább, mint a szemvizsgálat, az IFA TCID50 és a fertőző egységek megközelítése. Adataink azonban hangsúlyozzák a biológiai vizsgálatok elvégzésének fontosságát a vírus titerek pontos meghatározásához, ami indokolhatja a költségeket és a munkaerőt. Ezenkívül a HHV-6 mezőben alkalmazott vírustiter értékelési módszerek jobb szabványosítása növelheti a különböző vizsgálatok közötti összhangot.