È fondamentale avere il controllo del titolo virale nel lavoro sperimentale con i virus. Per facilitare il confronto tra studi effettuati in diversi laboratori è auspicabile l’uso di metodi standard armonizzati. Per l’herpesvirus umano 6 (HHV-6) , un β-herpesvirus a cui la maggior parte delle persone è stata esposta , il metodo TCID50 (Tissue culture infectivity dose) del 50% viene spesso utilizzato per la valutazione del titolo virale. Una lettura comunemente usata è l’ispezione oculare per gli effetti citopatici (CPE), cioè l’allargamento delle cellule infette . Un ostacolo con questo approccio è che le cellule possono ingrandirsi anche quando non sono infette. È particolarmente difficile al limite dell’infezione nella serie di titolazione ‘ poiché le cellule ingrandite a causa dell’infezione tendono ad ingrandirsi meno con una maggiore diluizione del virus (File aggiuntivo 1: Figura S1). Il test di immunofluorescenza (Immun) è un approccio di lettura alternativo all’ispezione oculare nella valutazione TCID50 o per il calcolo di unità infettive, cioè la frazione di cellule infette . La lettura basata su IF è più distinta nel discriminare le cellule infette da quelle non infette, ma la colorazione è laboriosa e un numero considerevole di cellule deve essere contato per ottenere valori affidabili. Il monitoraggio delle singole cellule implica il rischio di interpretare erroneamente la positività di una cellula, uno svantaggio sia dell’ispezione oculare che delle letture basate sull’IF. Quindi, abbiamo sviluppato e convalidato un approccio di lettura alternativo di TCID50 in cui l’aumento della carica di DNA virale viene misurato in ogni pozzetto di titolazione delle piastre di coltura TCID50 utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale (Q-PCR). Questo approccio è stato confrontato con l’ispezione oculare e le letture IF di TCID50 e con l’approccio delle unità infettive sopra descritto.
HHV-6A (ceppo GS) è stato propagato nella linea di cellule T HSB-2 in GlutaMAX contenente RPMI 1640 medium (Invitrogen, Regno Unito) integrato con siero bovino fetale al 10% (HyClone, UT), penicillina 100 U/ml e streptomicina 100 µg/ml (Invitrogen). Quando circa il 50% delle cellule vive si è ingrandito, il surnatante è stato raccolto e congelato immediatamente in aliquote a -80°C fino all’analisi. Come controlli, il surnatante virale del passaggio 17 (P17) è stato inattivato dalla luce UV per 20 min o con trattamento termico a 56°C per 1 h. La replicazione dell’HHV-6A nelle cellule HSB-2 è stata seguita per dieci giorni utilizzando Q-PCR (Applied Biosystems, Regno Unito) come descritto in precedenza . Prima dell’analisi Q-PCR, il DNA è stato estratto dalle sospensioni cellulari utilizzando un kit a base di perline a 96 pozzetti secondo il protocollo del produttore (MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit, Applied Biosystems). Per valutare il contenuto di DNA di HHV-6A nei lotti virali, la Q-PCR è stata eseguita come descritto sopra dopo l’estrazione del DNA utilizzando colonne filtranti (QIAGEN GmbH, Germania).
Per impostare le piastre di coltura TCID50, sono state seminate sospensioni di cellule di 40 µl 104 cellule HSB-2 per pozzetto in piastre di coltura a 96 pozzetti a fondo tondo. Le cellule sono state inoculate per 3-4 ore con 160 µl di diluizioni cinque volte di supernatante HHV-6A, sei repliche per diluizione. I controlli mock e medium sono stati inclusi in pozzetti triplicati su tutte le piastre. Le cellule sono state lavate una volta prima che 50-70 µl di sospensione cellulare fossero prelevati da ogni pozzetto e conservati a -80°C come campioni zero day post infection (dpi). Le restanti sospensioni cellulari sono state incubate per sette giorni a 37°C. A sette dpi, la piastra zero dpi scongelata e le sette piastre dpi sono state sottoposte all’estrazione del DNA utilizzando il kit a base di perline descritto sopra. Successivamente il DNA virale è stato quantificato mediante Q-PCR come descritto sopra.
Per l’IF le cellule sono state fissate su vetrini con una miscela 1:1 di acetone e metanolo a -20°C per 10 minuti, bloccate con siero di capra al 5% e BSA al 3% in PBS e colorate con un anticorpo monoclonale primario di topo specifico per la glicoproteina HHV-6 gp116/54/64 (Advanced Biotechnologies, MD). La colorazione è stata visualizzata da un IgG coniugato anti-topo di capra Alexa 633 (Invitrogen). La colorazione con 4′, 6-diamidino-2-fenilindolo (Vector laboratories, CA) è stata utilizzata per visualizzare i nuclei cellulari. I vetrini di copertura sono stati montati con supporti di montaggio (DAKO A / S, Danimarca) e i vetrini sono stati analizzati utilizzando un microscopio confocale (Leica Microsystems, Germania). La frazione di cellule infette è stata determinata dal conteggio manuale. Se ≥1/3 delle cellule conteneva proteine virali, sono state contate ≥25 cellule per pozzetto e se <1/3 delle cellule conteneva proteine virali, sono state contate ≥100 cellule per pozzetto. Pozzi in cui ≥2% delle cellule colorate positive sono stati considerati infetti. Il livello di aumento del carico di DNA virale in ciascun pozzetto è stato correlato alla colorazione IF costruendo una formula nel software Excel (Microsoft, WA). Questa formula chiede se il DNA virale in un certo pozzo nella piastra TCID50 ha spostato un certo numero di volte che è impostato, e se lo stesso pozzo era positivo in IF o no.
Per i confronti con la lettura Q-PCR, tutte le lastre TCID50 sono state valutate mediante ispezione oculare mediante microscopio a contrasto di fase da parte di due ispettori indipendenti (TCID50 oculare). I pozzi sono stati considerati infetti se è stata trovata almeno una cellula ingrandita. Per entrambi gli approcci di lettura il TCID50 è stato calcolato secondo la formula Reed e Muench .
I risultati TCID50 determinati dalla Q-PCR (Q-PCR TCID50) sono stati confrontati con la valutazione delle unità infettive da parte dell’IF (personal communication with Louis Flamand) a tre punti temporali per P19 e uno per P27. In breve, 2,5 * 105 cellule HSB-2 sono state inoculate come descritto sopra con varie diluizioni di virus in pozzetti triplicati per ogni diluizione. A due dpi le cellule sono state sottoposte a IF targeting della proteina virale precoce p41 (clone 9A5D12, Santa Cruz Biotech. Inc., CA) come descritto sopra. Il titolo virale, espresso come unità infettive per ml, è stato calcolato moltiplicando la frazione di cellule infette con il numero totale di cellule a zero dpi e fattori di diluizione.
Per determinare il punto di tempo ottimale per le misurazioni dell’aumento della carica del DNA virale, la replicazione del virus è stata seguita per dieci giorni. Sono stati necessari sette giorni per raggiungere un aumento sufficiente del DNA virale (Figura 1) ed è stato quindi scelto come tempo di raccolta. Per impostare il punto di taglio dell’aumento relativo del DNA virale corrispondente all’infezione positiva, l’aumento del carico di DNA virale è stato correlato con l’espressione della proteina virale. L’IF è stata eseguita a sette dpi su cellule di ogni pozzetto in tre piastre TCID50 per due diversi lotti di virus. Il punto di taglio ottimale è risultato essere un aumento di dieci volte nel DNA virale, dove la correlazione con l’espressione proteica è stata osservata nel 93% dei pozzetti (Figura 2).
Replicazione di HHV-6A (ceppo GS) seguita da Q-PCR. I dati mostrati sono risultati medi (± SEM) di colture triplicate per ogni molteplicità di infezione (MOI). Le linee di collegamento si interrompono quando il carico di DNA virale è sceso sotto il limite di rilevamento.
Determinazione del punto di taglio per l’infezione. Il punto di taglio ottimale per l’infezione è risultato essere un aumento di dieci volte in cui la correlazione con l’espressione proteica è stata osservata nel 93% dei pozzetti da IF con un anticorpo mirato alla proteina virale tardiva gp116/54/64. Nessuna proteina virale ben contenuta in cui la carica di DNA virale non era aumentata di dieci volte. I dati mostrati sono risultati medi (±SEM) da tre piastre TCID50.
Confrontando i valori di Q-PCR TCID50 con TCID50 oculare e TC, una Q-PCR TCID50 ha eguagliato 1,41 TCID50 oculare e 1,03 TC sulla base di 13 o 5 valutazioni rispettivamente. Q-PCR TCID50 non ha dato valori statisticamente diversi rispetto a TCID50 oculare o TC (p = 0,41 o p = 0,29 rispettivamente) (test t accoppiato) (Tabella 1).
Virale numero di copie di DNA sono spesso utilizzati come una stima approssimativa della quantità di particelle virali un particolare virale batch contiene. Tuttavia, non è chiaro quanto ciò corrisponda all’infettività. Per valutare questo, i valori di TCID50 sono stati confrontati con i numeri di copia del DNA virale per il rispettivo lotto. I rapporti medi tra carico di DNA virale e valori di Q-PCR TCID50 nei lotti di virus erano simili per P17 e P19; 6,3 * 105 e 2,0 * 106 copie di DNA virale per TCID50 rispettivamente. Per P21 tuttavia, il rapporto era considerevolmente più alto, 1,3 * 108 copie di DNA virale per TCID50 (Tabella 1). Pertanto, la misurazione del DNA virale nei supernatanti di batch non è sufficiente per assegnare correttamente l’infettività di un batch e pertanto devono essere eseguiti saggi biologici per determinare con precisione i titoli virali.
Il coefficiente medio di variazione intra-saggio (CV) per Q-PCR TCID50 era del 9%, determinato da estrazioni duplicate parallele e Q-PCR di tre piastre di coltura TCID50. Per TCID50 oculare il CV intra-saggio è stato del 45%, determinato da un totale di dodici piastre di coltura TCID50 lette da due valutatori indipendenti. Il CV intra-saggio è stato del 14% per TC TCID50 determinato da due colorazioni parallele di cellule da due cicli. Per l’approccio delle unità infettive, il CV intra-test è stato determinato al 43% da quattro colorazioni parallele di cellule da una corsa. Il CV inter-saggio medio è stato del 73% per Q-PCR TCID50 e del 66% per TCID50 oculare, determinato per tre lotti di virus eseguiti rispettivamente cinque, tre e tre volte. Per IF TCID50 il CV inter-test è stato del 25%, determinato per un batch eseguito tre volte. Per l’approccio delle unità infettive, il CV inter-test è stato del 77%, determinato da tre esecuzioni separate per un lotto.
In sintesi, il metodo Q-PCR TCID50 qui descritto correla bene con l’espressione delle proteine virali e quindi ha un’alta specificità per la dose infettiva. È più robusto di TCID50 oculare, TC TCID50 e l’approccio delle unità infettive, basato sui valori CV intra-analisi. Il CV intra-assay è in questa impostazione una misura di quanto sia preciso un certo approccio di lettura e quindi è il valore più accurato per i confronti dei diversi metodi. Per adattare il metodo, il punto di taglio deve essere determinato per ogni ceppo virale testato e ogni linea cellulare utilizzata. L’approccio di lettura Q-PCR è più laborioso dell’ispezione oculare, ma a nostro avviso molto meno laborioso dell’approccio TC TCID50 e delle unità infettive. È più costoso in termini di risorse di laboratorio rispetto all’ispezione oculare, all’TC TCID50 e all’approccio delle unità infettive. Tuttavia, i nostri dati sottolinea l’importanza di eseguire saggi biologici per determinare con precisione i titoli virali, che potrebbero giustificare il costo e la manodopera. Inoltre, una migliore standardizzazione dei metodi di valutazione del titolo virale utilizzati nel campo HHV-6 potrebbe aumentare la concordanza tra diversi studi.