DNA-gelelektrofores är en teknik som används för att separera och identifiera DNA-fragment baserat på storlek.
DNA – fragment av olika storlekar laddas i en porös gel tillverkad av agaros-ett kolhydrat som finns i röda alger.
när ett elektriskt fält appliceras kommer fragmenten att migrera genom gelen tack vare de negativt laddade fosfatgrupperna i DNA-nukleotider.
mindre bitar av DNA kommer lättare att migrera genom gelen än större fragment, som har svårare att röra sig genom gelmatrisen.
när gelkörningen är klar kan platsen för dina DNA-prover jämföras med en serie fragment eller band av kända storlekar, kallad en DNA-stege.
närvaron av ditt fragment av intresse kan sedan bekräftas baserat på dess storlek, vilket bestäms genom att jämföra den relativa platsen för ditt testprov med stegens fragment.
agarosgeler framställs med användning av en vikt över volymprocentlösning. Så 1 gram agaros i 100 ml buffert kommer att göra en 1% gel. Lägre procent geler kommer bättre att lösa större fragment och högre procent geler kommer att göra mindre fragment lättare att identifiera. För att starta geltillverkningsförfarandet, väg ut lämplig massa agaros i en Erlenmeyer-kolv.
Lägg till löpande buffert i kolven, så att buffertvolymen inte är större än 1/3 av kolvens kapacitet. Virvla sedan för att blanda.
smält agaros/buffertblandningen genom uppvärmning i en mikrovågsugn med maximal effekt. Var trettio sekunder, ta bort kolven och virvla innehållet för att blanda väl. Upprepa tills agarosen är helt upplöst.
Nästa tillsätt etidiumbromid till en koncentration av 0,5 mg/ml. Etidiumbromid är en aromatisk förening som passar in mellan enskilda baspar av DNA, eller interkalater, och får DNA att avge intensiv orange fluorescens under UV-ljus. Det är viktigt att notera att etidiumbromid är cancerframkallande, så handskar bör alltid bäras vid hantering av geler som innehåller denna förening.
för att förhindra att gelbrickan vrids, låt agarosen svalna genom att placera den i ett 65-ÅSKVATTENBAD.
när agarosen svalnar, förbered gelformen genom att placera gelbrickan i gjutapparaten. Som ett alternativ kan du använda tejp för att täta de öppna kanterna på gelbrickan för att skapa formen. Att placera en kam i gelen skapar brunnarna där DNA laddas. Se till att kammen skapar en brunn som är lämplig storlek för ditt DNA-prov.
häll den smälta agarosen i gelformen och låt den härda vid rumstemperatur.
efter att agarosen har härdat, ta ut kammen. Om gelen inte kommer att användas omedelbart, linda in den i plastfolie och förvara vid 4 OCCC tills användning.
om gelen ska användas omedelbart, placera den i gelboxen.
för att påbörja denna procedur, tillsätt gelladdande färgämne till DNA-proverna som ska separeras. Lastning färgämne görs typiskt vid en 6x koncentration. Loading dye hjälper till att visualisera och ladda prover i brunnarna och hjälper till att bestämma hur långt proverna har migrerat under körningen.
Ställ in strömförsörjningen på önskad spänning.
lägg nu till tillräckligt med löpande buffert i gelboxen för att täcka gelens yta. Se till att använda samma löpande buffert som den som används för att förbereda gelen.
Anslut ledningarna på gelboxen till strömförsörjningen och sätt på den. Kom ihåg att DNA är negativt laddat och kommer att röra sig mot anoden, som är positiv och i allmänhet röd i färg. Se till att inte ansluta den svarta ledningen eller katoden till botten av gelboxen. Så du glömmer inte, kom ihåg att svarta katter är otur eller negativa, och den svarta katoden är därför negativ. Kör din gel till rött eller anoden. För att verifiera att både gelboxen och strömförsörjningen fungerar; utseendet på bubblor vid elektroderna indikerar att strömmen passerar igenom.
ta bort locket på gelboxen. Ladda långsamt och försiktigt DNA-proverna i gelen. Återigen tillåter laddningsfärgen i provet att provet sjunker in i gelen och hjälper till att spåra hur långt provet har rest. En DNA-storleksmarkör, eller stege, bör alltid laddas tillsammans med experimentproverna.
Sätt tillbaka locket. Kontrollera att elektroderna är anslutna till rätt spår i strömförsörjningen.
slå på strömmen. Kör gelen tills färgämnet har migrerat till ett lämpligt avstånd.
när elektroforeskörningen är klar, stäng av strömförsörjningen och ta bort locket på gelboxen.
ta bort gelen från gelboxen och töm bort överflödig buffert på gelens yta. Placera gelbrickan på pappershanddukar för att absorbera kvarvarande buffert.
för att visualisera DNA-fragmenten, ta bort gelen från gelbrickan och exponera gelen för ultraviolett ljus.
DNA-fragment ska dyka upp som orange fluorescerande band. Ta en bild av gelen.
i slutet av experimentet ska du kassera Gel-och körbufferten per institutionsregler. Återigen, kom ihåg att alltid hantera gel och löpande buffertar med handskar för att undvika exponering för etidiumbromid.
nu när du har sett hur man utför DNA-gelelektrofores. Låt oss ta en titt på några nedströms applikationer och variationer av denna mycket användbara metod.
här ser du ett agarosgelelektroforesresultat efter separering av PCR-produkter. DNA-fragmenten laddade i gelen är synliga som tydligt definierade band. DNA-standarden eller stegen bör separeras i en grad som möjliggör användbar bestämning av storleken på provband. I detta exempel separeras DNA-fragment av 765 baspar, 880 baspar och 1022 baspar på en 1,5% agarosgel med en 2-log DNA-stege.
förutom att bekräfta närvaron av ett DNA-fragment av intresse kan DNA-gelelektrofores kombineras med gelreningsprocedurer. Vanligtvis används ett rakblad för att skära ut DNA-fragmentet av intresse, så att det kan samlas in och DNA-provet i det återvinns.
Agarosgelelektrofes kan också kombineras med transferblotting, vilket innebär att DNA eller RNA kan överföras till ett cellulosamembran där radioaktiva sonder kan användas för att identifiera specifika DNA-eller RNA-sekvenser i ditt elektroforetiskt separerade prov.
Standard DNA-gelelektrofores är inte idealisk för separation av DNA med hög molekylvikt större än 15-20 kb i storlek, som genomiskt DNA. För att separera stora DNA-prover används pulsfältgelelektrofores, vilket innebär att gelen utsätts för ett föränderligt eller pulserande elektriskt fält i olika riktningar. Denna teknik involverar en specialiserad gelkörningsapparat, som har Par elektroder ordnade i olika riktningar runt gelen. Detta kan användas för att upptäcka skillnader i genomstorlekar mellan populationer av organismer, som de poolade DNA-proverna från olika mikrobiella samhällen, du ser här som tas från olika sjömiljöer.
du har just sett en introduktion till DNA-gelelektrofores. Vi visade dig konceptet bakom metoden, hur man förbereder agarosgelen, hur man laddar dina prover, hur man kör gelen och analyserar den och några vanliga tillämpningar av agarosgelelektrofores. Tack för att du tittade och lycka till med att köra din gel.