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Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa ambiental ubicua que se encuentra en el suelo y el agua. También es un patógeno oportunista que causa infecciones en individuos con defectos inmunitarios innatos, incluidos los pacientes con fibrosis quística (FQ) (8). P. aeruginosa encuentra ambientes de bajo oxígeno en el suelo y el agua. La evidencia indica que en humanos con FQ, las bacterias pueden, al menos en parte, estar en un ambiente de bajo oxígeno dentro de masas mucopurulentas o biopelículas dentro de las vías respiratorias (19). P. aeruginosa es capaz de crecer anaeróbicamente en presencia de aceptores terminales de electrones, como nitrato (NO3−), nitrito (NO2−) y óxido nitroso (N2O), o cuando la l-arginina es un sustrato para el crecimiento (21). El moco de las vías respiratorias con FQ es lo suficientemente rico en NO3 y NO2 para apoyar el crecimiento anaeróbico de P. aeruginosa (7, 19). En este estudio, se realizó una comparación del proteoma de P. aeruginosa durante el crecimiento en presencia y ausencia de oxígeno.

P. la cepa aeruginosa PAO1 obtenida de Steve Lory (Harvard Medical School, Boston, MA) se cultivó en frascos de 125 ml en caldo Luria (LB) suplementado con 1% de KNO3 con agitación a 200 rpm a 37°C para crecimiento aeróbico. El crecimiento anaeróbico se completó como se describió anteriormente (9) en 80 ml de medio en frascos de suero Wheaton de 100 ml (Fisher Scientific) con tapones de goma. El medio fue privado de oxígeno al ser sometido a burbujeo con gas N2 durante 1 h. Para condiciones aeróbicas y anaeróbicas, las bacterias se recolectaron en la fase logarítmica tardía de crecimiento, momento en el que la densidad celular (densidad óptica a 600 nm) del cultivo anaeróbico fue del 44% de la densidad del cultivo aeróbico. No hubo diferencia significativa entre el PH de los cultivos cosechados (pH 7,6 para el cultivo anaeróbico y pH 7,4 para el cultivo aeróbico). Cantidades iguales de proteína de células enteras desnaturalizada y reducida (2.0 mg de cada estado de crecimiento) se etiquetaron con reactivo clivable de etiqueta de afinidad codificada por isótopos (ICAT) ligero (12C) o pesado (13C) (Applied Biosystems, Foster City, CA), se procesaron y analizaron como se describió anteriormente (3). Los datos reportados son los promedios de al menos dos experimentos independientes.

seiscientas diez proteínas P. aeruginosa fueron identificadas y cuantificadas usando ICAT (para una lista completa de proteínas, ver Tabla S1 en el material suplementario). De las 151 proteínas cuyas abundancias cambiaron durante el crecimiento anaeróbico, 76 fueron más abundantes (Tabla (Tabla 1) 1) y 75 fueron más abundantes (Tabla (Tabla 2).2). Como se esperaba, 13 proteínas que participan en el crecimiento anaeróbico y la desnitrificación (incluidos los productos de los genes nir, nos y nar) se expresaron en niveles más altos durante el crecimiento anaeróbico (Tabla (Tabla 1).1). Estos resultados sugieren que los cambios observados en el contenido de proteínas incluyen aquellos que resultan específicamente del crecimiento a diferentes niveles de oxígeno.

Los cambios en el proteoma detectado también podrían reflejar diferencias en toda la regulación dependiente de la densidad, además de los efectos de la tensión de oxígeno, dada la menor densidad celular relativa del cultivo anaeróbico cosechado. De hecho, 29 proteínas detectadas en menor abundancia en células crecidas anaeróbicamente están codificadas por genes que se ha demostrado que son inducidos por detección de quórum (5, 16, 17). Estos incluyen las subunidades de cianuro de hidrógeno sintasa HcnB y HcnC; las Pseudomonas quinolonas señalan enzimas biosintéticas PqsB, PqsC y PqsD; y PhnB (Tabla (Tabla 2).2). De acuerdo con nuestros resultados, también se encontró que los genes hcn y pqs se reprimen transcripcionalmente durante el crecimiento anaeróbico mediante un análisis reciente de microarrays de ADN utilizando cultivos aeróbicos y anaeróbicos cosechados a la misma densidad celular (1) (Tabla (Tabla 22).

Para identificar secretada P. proteínas aeruginosas con niveles alterados durante el crecimiento anaeróbico, las proteínas sobrenadantes de cultivo se concentraron (11) y se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) (Fig. (Higo.1).1). Se identificaron y analizaron cuatro bandas de proteínas teñidas de Coomassie, correspondientes a proteínas expresadas diferencialmente, como en un estudio previo (4) (Fig. (Higo.1).1). La abundancia de tres proteínas secretadas pareció disminuir durante el crecimiento anaeróbico: la proteína de unión a quitina CbpD, la elastasa LasB y una proteína de función desconocida codificada por PA0572. Estudios proteómicos previos encontraron que estas tres proteínas son inducidas por detección de quórum (11). Una proteína parecía aumentar en abundancia durante el crecimiento anaeróbico y se identificó como el FliC de proteína de filamento flagelar o el FliD de proteína de tapado flagelar (debido a la superposición de características de estas dos proteínas).

La mayoría de las proteínas de la membrana externa de P. aeruginosa no contienen residuos de cisteína y, por lo tanto, no pueden ser analizadas por ICAT (4). Por lo tanto, se utilizó una PÁGINA bidimensional (2D) como método complementario (4). Varias proteínas de membrana externa (Fig. (Higo.2) 2) fueron extirpados del gel 2D e identificados (4). La OprE parecía aumentar en abundancia durante el crecimiento anaeróbico, mientras que la OprF y la OprH parecían disminuir en abundancia (Fig. (Higo.2).2). Las tres proteínas migraron como especies múltiples durante el enfoque isoeléctrico (Fig. (Higo.2).2). La disminución de la abundancia de OprF durante el crecimiento anaeróbico se confirmó mediante inmunoblotación de proteínas de la membrana externa (datos no mostrados), utilizando un antisuero policlonal anti-OprF (un regalo de Robert Hancock, Universidad de Columbia Británica en Vancouver, Canadá).

Entre las proteínas P. aeruginosa que mostraron una mayor abundancia durante el crecimiento anaeróbico (Tabla (Tabla 1; 1; Fig. Higo.1), 1), varios contribuyen a las funciones involucradas en la formación y desarrollo de biopelículas. Estas proteínas incluyen la proteína de control de represión de catabolitos Crc y las proteínas de motilidad de contracción PilU, PilG y ChpA (12, 13, 18). De acuerdo con un aumento de los niveles de Ccr en células cultivadas anaeróbicamente (Tabla (Tabla 1),1), los objetivos conocidos de represión del Ccr disminuyeron en abundancia (Tabla (Tabla 2),2), incluidos los productos de los genes hmgA y bkd (6, 10). ChpA y PilG son componentes de un complejo sistema regulador que controla la motilidad de las espasmos (18). En conjunto, estos resultados sugieren que la expresión o función de los apéndices de la superficie celular que afectan la formación de biopelículas se altera durante el crecimiento anaeróbico. Tales cambios pueden contribuir al aumento de la formación de biopelículas observado para el crecimiento anaeróbico de P. aeruginosa (20).

Además de los cambios en las proteínas de la membrana externa observados durante el crecimiento anaeróbico, el análisis ICAT mostró que varias enzimas involucradas en la biosíntesis del lipopolisacárido de P. aeruginosa (LPS) se expresaron en niveles más altos durante el crecimiento anaeróbico (Tabla (Tabla 1).1). Estos incluyen un homólogo de la beta-hidroxilasa LpxO2, que hidroxila los ácidos grasos lipídicos A (14); heptosiltransferasas del núcleo LPS WaaC y WaaF (2, 15); y WbpG, que es codificada por un grupo de genes que participa en la síntesis de un antígeno de banda B larga O. Estos resultados sugieren que el contenido de LPS podría alterarse como consecuencia de la anaerobiosis.

En resumen, el proteoma de P. aeruginosa cambia significativamente durante el crecimiento anaeróbico. Identificamos 617 proteínas en total: 610 por análisis ICAT, 4 por análisis DE PÁGINAS SDS y 3 por análisis de páginas 2D. De las 617 proteínas identificadas, las abundancias de 158 variaron entre células crecidas anaeróbicamente y células crecidas aeróbicamente. Debido a que P. aeruginosa alcanzó una densidad celular más baja en nuestras condiciones de crecimiento anaeróbico que en condiciones de crecimiento aeróbico, los cambios dependientes de la densidad en la expresión de proteínas pueden haber contribuido al proteoma que detectamos durante el crecimiento anaeróbico. Sin embargo, es probable que la densidad celular bacteriana sea igualmente limitada en muchos nichos ambientales donde escasean múltiples nutrientes (incluido el oxígeno). Por lo tanto, los cambios en los niveles de proteínas que hemos detectado contribuyen a comprender cómo el proteoma y el estado metabólico de las bacterias varían en respuesta a diferentes entornos. El análisis directo del contenido de proteínas bacterianas es una tecnología robusta para observar la adaptación de bacterias a nichos ambientales específicos, incluida la vía aérea con FQ.