Poisson-distribution, uppkallad efter den franska matematikern Simbuni Denis Poisson, är sannolikheten för förekomst av ett givet antal händelser under en given (fast) tidsperiod om händelserna inträffar med konstant hastighet (känd) och är oberoende av förekomsten av den tidigare händelsen. Den är baserad på en diskret sannolikhetsfördelning, där uppsättningen resultat är diskreta eller ändliga, såsom kasta av ett mynt eller tärningsrulle.
i samband med ett digitalt PCR-experiment är de diskreta resultaten närvaron eller frånvaron av målgenen. De tusentals enskilda partitionerna som produceras för en digital PCR-reaktion förväntas följa en Poisson-distribution med tanke på att partitionerna är monodisperserade och de innehåller motsvarande volym av provblandningen.
om dessa parametrar inte uppfylls och partitionerna uppvisar polydispersitet, kommer volymen av provblandning i partitionerna att variera till stor del och de större partitionerna kan innehålla fler mål än de mindre, vilket sänker precisionen hos den digitala PCR-reaktionen.
i denna artikel går vi igenom den matematiska beräkningen av Poisson-lagen för ett digitalt PCR-experiment.
för ett digitalt PCR-experiment, en brunn som innehåller det partitionerade provet av intresse och en målgen för att kvantifiera, måste vi först definiera följande variabler:
- \(n\): totalt antal analyserbara partitioner i brunnen
- \(p\): antal positiva partitioner för målgenen
- \(v\): volym av partitionen (i aucyl), antas vara konstant
- \(d\): utspädningsfaktor som används för att späda provet från beståndet till brunnen
(t. ex.\ (d=10\) betyder att provet har utspätt 10 gånger)
och sedan dessa ytterligare:
-
\(V = n \ v\ ) : Total partitionsvolym injicerad i brunnen
-
\(C_{0}\) : koncentration av målgener i brunnen (i kopior / )
-
\( C = d \ c_{0}\): koncentration av målgener i beståndet (i kopior / )
-
\(\ lambda = c_{0} \ v\): genomsnittligt antal målgener per partition i brunnen
fördelningen av målgenerna inkapslade i brunnens partitioner följer en Poisson-fördelning av parameter \(\lambda\):
Proba (partition inkapslar \(\text{$k$}\) målgener) \(=\dfrac {\lambda^k}{k!} e^{- \lambda}\)
en partition sägs:
-
”positiv partition” om den har inkapslat minst 1 målgen (i vilket fall vi kommer att observera en fluorescerande partition vid amplifieringsprocessens slutpunkt, så det mesta av osäkerheten ligger i detta” minst ett ” tillstånd)
-
”negativ partition” om har inkapslat 0 målgen (i vilket fall vi kommer att observera en icke-fluorescerande partition vid slutpunkten för amplifieringsprocessen)
fördelningen av positiva partitioner i brunnen följer en binomial fördelning av sannolikhet \(1 – e^{- \lambda}\):
- Sannolikhet (väl innehåller \(\text{$p$}\) positiva partitioner \(= {\rm c}_{n}^{p} (1 – e^{-\lambda})^p (e^{-\lambda} )^{N-p} \)
- Sannolikhet (partitionen är negativ) \( = e^{-\lambda} \)
- Sannolikhet (partitionen är positiv) \( = 1 – e^{-\Lambda} \)
om \(N\) är tillräckligt stor:
- Proba (partitionen är positiv) \ (=\dfrac{p}{N} \)
så formeln för den uppskattade lagerkoncentrationen är:
\ (C = – \ dfrac{d}{v} \ ln{\vänster (1 – \dfrac{p}{n} \ höger)} \)
om du automatiskt behöver beräkna uppskattade koncentrationer av målgener, tillsammans med deras konfidensintervall och relativ osäkerhet, finns ett onlineverktyg tillgängligt: Poisson Law: Going Further. Prova det!
för mer information om osäkerhetskurvorna, liksom gränserna för detektering och kvantifiering, se artikeln: dynamiska Detektionsområden & kvantifiering.